БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 8, с. 1240 - 1249
УДК 578.2
УВЕЛИЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ НАКОПЛЕНИЯ ЦЕЛЕВОГО БЕЛКА В РАСТЕНИИ ПУТЕМ ЕГО ЭКСПРЕССИИ ПОД КОНТРОЛЕМ ДВУХ СУБГЕНОМНЫХ ПРОМОТОРОВ В СОСТАВЕ ФИТОВИРУСНОГО ВЕКТОРА*
© 2015 Е.В. Путляев1***, А.А. Смирнов1#, О.В. Карпова1, И.Г. Атабеков1,2
1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 119991 Москва; факс: +7(495)938-0601,
электронная почта: putlegor@mail.ru
2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,
НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, 119991 Москва; факс: +7(495)938-3181, электронная почта: okar@genebee.msu.ru
Поступила в редакцию 30.01.15 После доработки 06.03.15
В ходе данной работы были созданы несколько вирусных векторов, имеющих архитектуру деконструиро-ванного вируса и позволяющих экспрессировать гетерологичные белки в организме растений. В качестве основы для создания этих векторов был использован геном вируса мозаики альтетнантеры (ВМАльт) линии Ми. Первый из серии полученных векторов (АкМУ^^е) имел структуру, характерную для вирусных векторов этого типа, то есть из генома ВМАльт был удален тройной блок генов, а целевой ген находился под контролем первого субгеномного промотора ВМАльт. Второй, созданный нами вектор (АЙМУ-ёоиЫе), отличался от АкМУ^^е наличием двух различных вирусных субгеномных промоторов, контролирующих экспрессию целевого гена. Нами было продемонстрировано, что АкМУ-ёоиЫе обеспечивает существенно более высокий уровень аккумуляции целевого белка, чем АкМУ^^е. Кроме того, нами было выяснено, что для обеспечения наблюдаемого усиления экспрессии требуется наличие и функционирование обоих субгеномных промоторов в составе АкМУ-ёоиЫе. На основании представленных данных нами был сделан вывод о том, что описанный в данной работе способ контроля экспрессии целевого гена с помощью двух субгеномных промоторов, использованный при создании вектора АкМУ-ёоиЫе, является дополнительной возможностью увеличения эффективности экспрессии целевого гена, осуществляемой фитовирусным вектором.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: вирус мозаики альтернантеры, вирусный вектор, суперпродукция целевого белка, субгеномный промотор.
В настоящее время разработано значительное количество технологий, позволяющих эффективно экспрессировать чужеродные белки в растениях, такие как ферменты, белки-компоненты вакцин, цитокины и другие белки медицинского назначения [1—5]. Эти технологии,
Принятые сокращения: ВМАльт — вирус мозаики альтернантеры; ОРС — открытая рамка считывания; ТБГ — тройной блок генов; чГ-КСФ — гранулоцитарный коло-ние-стимулирующий фактор человека; сгРНК — субгеномная РНК; СГП — субгеномный промотор транскрипции; БО — белок оболочки; д.п.и. — дней после инъекции; с.л.м. — сырая листовая масса.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 15-029, 12.04.2015.
** Адресат для корреспонденции.
# Авторы внесли равный вклад в работу.
предполагающие использование растений в качестве фабрик для производства трансгенных белков, имеют ряд преимуществ, таких как высокий выход конечного продукта, его низкую себестоимость и высокий уровень биобезопасности, в силу отсутствия общих патогенов у животных и растений [5]. Стратегия временной экспрессии часто используется для увеличения продукции рекомбинантного белка. Эта стратегия заключается в том, что целевой ген доставляется в клетки растения с помощью вирусного вектора. Увеличение эффективности продукции трансгенного белка в растениях является важной задачей современной биотехнологии [4].
Представители рода Potexvirus (потексвиру-сы) — группы РНК-содержащих вирусов, имеющих нитевидные вирионы [6, 7], — одни из наи-
более часто используемых для создания вирусных векторов по сравнению с другими растительными вирусами. Геном потексвирусов представлен одноцепочечной молекулой РНК, содержащей 5 открытых рамок считывания (ОРС). Продукт трансляции ОРС1 является вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразой (реплика-зой) и транслируется непосредственно на матрице геномной РНК, остальные 4 ОРС транслируются на матрицах 3 специфических субгеномных РНК (сгРНК), синтез которых происходит под контролем трех субгеномных промоторов (СГП). ОРС 2, 3 и 4 принято называть «тройным блоком генов» (ТБГ, [8]), а продукты трансляции этих ОРС соответственно принято обозначать ТБ1 (продукт трансляции сгРНК1), ТБ2 и ТБ3 (трансляция обоих белков происходит на матрице сгРНК2). Данные белки участвуют в процессах межклеточного и системного распространения вируса, не являясь при этом строго необходимыми компонентами вирусной репликации. Белки ТБГ являются транспортными белками вируса, также участвуя в процессах, не связанных напрямую с транспортом [9, 10]. Пятая, последняя ОРС кодирует белок оболочки вирионов (БО), накапливающийся в наибольших количествах по сравнению с другими вирусными белками. Трансляция ОРС5 происходит на матрице сгРНКЗ.
За последние 20 лет был разработан ряд стратегий, предполагающих использование вирусных векторов, созданных на основе геномов РНК-содержащих фитовирусов, для экспрессии целевых белков в растениях [5]. Одна из наиболее эффективных стратегий получила название «стратегий деконструированного вируса» [4, 5]. Она основывается на том, что доставка векторной кДНК внутрь растительных клеток осуществляется посредствам агробактерии, т.н. методом агроинъекции [5], обеспечивающим доставку кДНК почти в 100% клеток, находящихся в зоне агроинъекции. При этом подходе нет необходимости в наличии транспортных белков вируса, поэтому можно удалить кодирующие их ОРС из состава векторной кДНК. В свою очередь, удаление ОРС транспортных белков снимает известные ограничения, накладываемые на размер трансгенной вставки в вектор, а также ликвидирует конкуренцию за клеточные ресурсы между ОРС транспортных белков и целевым геном.
Недавно в нашей лаборатории [13] был описан новый штамм вируса мозаики альтернанте-ры — ВМАльт-MU (Alternanthera mosaic virus, AltMV-MU, GeneBank FJ822136.1), представитель семейства Alphaflexiiviridae, рода Potexvirus [11, 12]. Геномная молекула РНК ВМАльт (рис. 1, a)
имеет длину 6606 нт и организацию, характерную для потексвирусов [13]. Ранее для создания двукомпонентного вектора для экспрессии целевого белка был использован другой штамм ВМАльт - АкМУ-8Р [14]. В данной работе описан способ повышения уровня экспрессии целевого гена, обеспечиваемого вирусными векторами, созданными по принципу деконструирован-ного вектора на основе геномов потексвирусов. Предложенный метод заключается в использовании двух последовательно расположенных субгеномных вирусных промоторов для контроля экспрессии целевого гена. Созданы несколько вирусных «деконструированных» векторов на основе генома ВМАльт штамма Ми, один из которых позволил достигнуть значительного уровня экспрессии целевого белка в растениях Nicotiana benthamiana.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Создание векторов на основе последовательности генома ВМАльт. Для создания векторов была использована последовательность кДНК копии генома АкМУ-Ми [13]. Полная последовательность кДНК копии генома АкМУ-Ми ранее получена в форме ряда фрагментов, клонированных в плазмиды рВ1ие8спр1 8К+; рАкМУ19
а
AltMV-MU
| Репликаза |
СГШ СГП2 СГПЗ 1 213
БО |
m'C-KJii
ТрОЙНОЙ 6JJOK ГвНОВ
<А)П
AltMV-single СГп1
_Г
35S
I—Репликаза БО |
nos
AltMV-double cm 1 СГПЗ
35S ■-Си ri--1
И Репликаза | | БО |
nos
Рис. 1. Схема расположения основных элементов в составе генома ВМАльт-MU и векторов, созданных на основе его последовательности. а — Схема геномной РНК ВМАльт-MU; б - AltMV-single; в - AltMV-double; СГП 1, 2, 3 -предполагаемые промоторы синтеза субгеномных РНК. 35S — промотор транскрипции 35S вируса мозаики цветной капусты. nos — терминатор транскрипции гена нопа-линсинтетазы. (A)n — полиаденилатный тракт
(1-1639 нт); pAltMV12 (1292-3446 нт); pAltMV46 (3279-4488 нт); pAltMV33 (4335-5559 нт); pAltMV50 (5479-6606 нт). Порядковые номера первого и последнего нуклеотидов соответствующих фрагментов в геноме AltMV-MU (1-6606 нт, Gen Bank FJ822136.1) указаны в скобках. pPVX201 [14] был использован в качестве ПЦР-матрицы для получения последовательностей 35S промотора транскрипции (35S) вируса мозаики цветной капусты и терминатора транскрипции гена нопалин-синтетазы (nos).
Нуклеотидные последовательности молекул ДНК, использованных при создании векторов
на основе генома АкМУ-МИ, представлены в табл. 1 с указанием названий олигонуклеотид-ных праймеров для ПЦР и специфических эн-донуклеаз рестрикции. Последовательности нук-леотидов всех праймеров для ПЦР, использованных в работе, приведены в табл. 2.
Для создания АкМУ-вт^е (рис. 1, б) фрагмент последовательности генома АкМУ-МИ (с 4725 по 5762 нт) был удален, а старт-кодон трансляции ТБ1 был заменен с ATG на ACG. Полученная таким образом последовательность была вставлена в плазмиду рСашЫа1300 вместе с полученными ранее последовательностями
Таблица 1. Схема получения промежуточных фрагментов ДНК, использованных для создания вирусных векторов на основе последовательности генома АкМУ-МИ
Название результирующего фрагмента ДНК Названия фрагментов ДНК, использованных в реакции Названия специфических эндонуклеаз рестрикции или специфических олигонуклеотидных праймеров, использованных в соответствующих реакциях специфического расщепления или амплификации
PCR1 pPVX201 AL2015, AL2016
PCR2 AltMV19 AL2021, AL2020
PCR3 PCR1, PCR2 AL2016, AL2020
PCR4 AltMV33 AL2012, AL2011
PCR5 AltMV50 AL2014, AL2013
PCR6 PCR4, PCR5 AL2012, AL2013
Restr1 AltMV19 БеоВ!, AfeI
Restr2 AltMV12 Брк1
Restr3 pPVX201 Крп1, БеоВ!
Restr4 AltMV12 BglII, БрМ
Restr5 AltMV46 BglII, БеоВУ
Restr6 AltMV46 БеоВУ ВатН1
Restr7 AltMV33 ВатН1, SpeI
PCR7 AltMV33 AL2012, AL2018
PCR8 AltMV50 AL2019, AL2013
PCR9 PCR7, PCR8 AL2012, AL2013
PCR10 AltMV-double AL2012, AL2038
PCR11 AltMV-double AL2029, AL2013
Restr8 PCR10 SpeI, БаИ
Restr9 PCR11 БаИ, Крп1
Restr10 AltMV-double SpeI
Restr11 Restr10 БаП
Restr12 AltMV-double Крп1
Restr12 Restr11 БаП
PCR11 Al
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.