РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2007, том 47, № 4, с. 402-407
^ МОЛЕКУЛЯРНАЯ ^^^^^^^^^^^^^^
РАДИОБИОЛОГИЯ
УДК [577.2:539.1.04]+576.346
В КЛЕТКАХ КРОВИ ОБЛУЧЕННЫХ МЫШЕЙ НАБЛЮДАЕТСЯ ИЗМЕНЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА КОПИЙ И ТРАНСКРИПЦИЯ МТДНК, А В СЫВОРОТКЕ ПОЯВЛЯЮТСЯ ЕЕ ФРАГМЕНТЫ
© 2007 г. Э. В. Евдокимовский*1, 2, М. В. Патрушев1, Т. Е. Ушакова1' 2, А. И. Газиев1, 2
1Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино 2 Пущинский государственный университет, Пущино
Исследовали количество копий митохондриальной ДНК (мтДНК), ее транскрипцию в клетках крови, а также появление внеклеточных фрагментов мтДНК в сыворотке крови у мышей после общего рентгеновского облучения. Методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) показано, что через 1 ч после воздействия рентгеновского излучения в дозе 1 Гр в клетках крови у мышей происходит резкое увеличение числа копий мтДНК. Наблюдаемое увеличение рассматривается как результат развития компенсаторной реакции на радиационное повреждение части молекул мтДНК, необходимых для биогенеза энергии. Воздействие рентгеновского излучения в дозе 10 Гр приводит к блокировке репликации мтДНК в клетках крови в течение 3 ч пострадиационного времени. При анализе продуктов обратной транскрипции ПЦР-РВ показано, что при этой же дозе облучения у животных происходит увеличение количества копий мРНК митохондриального гена nd6 относительно аналогичного показателя мРНК ядерного гена gapdh. Это свидетельствует о том, что, хотя мтДНК больше повреждается по сравнению с яДНК, процесс транскрипции продолжает функционировать в митохондриях клеток крови мышей после облучения, тогда как он блокирован на поврежденной яДНК. При облучении мышей в дозе 10 Гр в сыворотке крови обнаружено появление фрагментов мтДНК длиной 1841 п.н. (пар нуклеотидов). Таким образом, после рентгеновского облучения в клетках крови мышей резко изменяется количество копий мтДНК и ее транскрипция, а в сыворотке появляются большие фрагменты мтДНК.
Рентгеновское излучение, повреждение мтДНК, клетки крови мышей, фрагменты мтДНК в сыворотке крови.
Изучение повреждения ДНК в клетках периферической крови животных и человека, подвергнутых радиационному воздействию, представляет интерес не только для понимания механизмов формирования лучевой реакции, но и для создания молекулярных и клеточных маркеров оценки уровня радиационного поражения организма. Почти все исследования радиационных повреждений генетического материала клеток крови связаны с изучением нарушений ядерной ДНК (яДНК). Однако клетки человека и животных содержат множество копий ковалентно замкнутых молекул (размером около 16 тыс.п.н.) митохондриальной дНк (мтДНК), кодирующих 13 полипептидов дыхательной цепи. Как показывают результаты исследований последних лет по молекулярной генетике митохондрии, изучение нарушений структуры и функций мтДНК в тканях облученного организма требует определенной специфики подхода, связанного с ее структурно-функциональными характеристиками, отличными от аналогичных для
*Адресат для корреспонденции: 142290 Пущино, Московская обл., ул. Институтская, 3; тел.: (4967) 73-92-77; e-mail: deadace@rambler.ru.
яДНК [1-3]. Так, мтДНК, по сравнению с яДНК, более уязвима для эндогенных и экзогенных агентов [3-5]. В митохондриях ограниченно функционируют различные системы репарации ДНК [6]. Поскольку мтДНК не содержит некодируемых последовательностей, она транскрибируется как единый полицистронный блок и любые нарушения в ней, в отличие от яДНК, являются патогенетически значимыми. Репликативный синтез мтДНК протекает независимо от клеточного цикла и репликации яДНК в течение всей жизни организма [1, 3]. Как показывает ряд данных, в отличие от яДНК, репликация поврежденной мтДНК не блокируется системой контроля хода клеточного цикла [6]. Это приводит к формированию в мтДНК мутаций с высокой частотой [3, 5], с которыми связано нарушение энергозависимых путей клеточного метаболизма, активация клеточной гибели, развитие дегенеративных процессов и различных патологий [3, 4]. Вместе с тем сведения о формировании нарушений мтДНК в клетках человека или животных, подвергшихся радиационному воздействию на уровне целостного организма, в литературе численно ограниче-
Праймеры и зонды, использованные для проведения ПЦР
Название и позиция Последовательность 5' —»- 3'
MC1F 14189 DIR 16029 ND6 For 13603 ND6 Rev 13719 ND6 probe GAPDH For GAPDH Rev GAPDH Probe CCA CTC ATT CAT TGA CCT ACC TGC C TAG GTG ATT GGG TTT TGC GGA CTA CCC AGC TAC TAC CAT CAT TCA AGT GAT GGT TTG GGA GAT TGG TTG ATG T R6G-TTG CCG CTA CCC CAA TCC CTC CTT CCA ACA-BHQ2 GTG AGG GAG ATG CTC AGT GT CTG GCA TTG CTC TCA ATG AC R6G-TAA GAA ACC CTG GAC CAC CCA CCC C-BHQ2
ны, хотя проблема является чрезвычайно актуальной. Исследование нарушений мтДНК в клетках крови может способствовать созданию молекулярных маркеров для мониторинга гено-токсического груза при проведении лучевой терапии опухолей [7-10].
В настоящей работе мы исследовали изменение количества копий мтДНК и ее транскрипцию в клетках периферической крови мышей после рентгеновского облучения, а также наличие внеклеточных фрагментов мтДНК в сыворотке крови этих же животных.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
В настоящем исследовании использовали самцов мышей линии BALB/с 2-месячного возраста из питомника экспериментальных животных Филиала Института биоорганической химии (г. Пу-щино). Мышей, в количестве 3-5 особей на точку, подвергали общему воздействию рентгеновского излучения на установке "РУТ 250-15-1" (Россия) при мощности дозы 2 Гр/мин. После облучения мышей содержали в стандартных условиях вивария. Через различные сроки после облучения мышей декапитировали и собирали кровь в пластиковые пробирки типа "Eppendorf". Кровь разделяли на сыворотку и форменные элементы методом пассивного осаждения. Через 1 ч инкубации при 37°С пробирки центрифугировали и сыворотку осторожно отбирали. Из форменных элементов тотальную ДНК выделяли, как указано в работе [11]. Образцы ДНК осаждали и дважды промывали этанолом (70%), подсушивали на воздухе и растворяли в 50 мкл трис-ЭДТА (ТЕ)-буфера (10 ммоль/л трис-HCl с рН 8.0, 1 ммоль/л ЭДТА).
ДНК из сыворотки крови выделяли с помощью магнитных сорбентов [11]. Для этого к 70 мкл сыворотки добавляли 5 мкл 1 моль/л трис-HCl, pH 8.0, 25 мкл 4 моль/л NaCl и 10 мкл суспензии магнитных сорбентов ("Promega", США). После инкубации в течение 15 мин при 55°С проводили связывание сорбентов на магнитном штативе. Элюцию ДНК с сорбентов осуществляли в ТЕ-бу-фере в объеме 70 мкл в течение 15 мин при 65°С.
Тотальную РНК из форменных элементов крови выделяли по методу, описанному в работе [12].
Определение количества копий мтДНК относительно гена gapdh яДНК проводили методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) на амплификаторе "МХ3000" ("Stratagene", США). Система ПЦР-РВ и ПЦР-РВ продуктов обратной транскрипции (ОТ-ПЦР-РВ) включала технологию TaqMan, основанную на использовании Taq-полимеразы, обладающей 5'-экзо-нуклеазной активностью ("ThermoStar"™, "Хели-кон", Россия). В реакцию вводили зонды с флуо-рофором на 5'-конце и тушителем на З'-конце олигонуклеотида. Все реакции ПЦР-РВ проводили в буфере, содержащем 10 ммоль/л трис-HCl с pH 8.3, 50 ммоль/л KCl, 0.25 ммоль/л дезокси-нуклозидтрифосфатов (dNTPs), 2.5 ммоль/л Mg2+, 300 нмоль каждого праймера и 150 нмоль каждого зонда, 1.5 ед. Taq-полимеразы. Праймеры и зонды, использованные для количественного определения мтДНК, указаны в таблице.
Для измерения уровня транскрипции мтДНК гена nd6, относительно аналогичного для мРНК ядерного гена gapdh, осуществляли синтез первой цепи кДНК по следующей процедуре: 2 мкл мРНК и 1 мкл олиго^(Т)18-праймера инкубировали 5 мин при 70°С, затем помещали в лед, добавляли буфер, содержащий 10 ммоль/л трис-HCl с pH 8.3, 50 ммоль/л KCl, 0.2 ммоль/л dNTPs, 1.6 ммоль/л Mg2+, 1 мкл RNAsin™ ("Fermentas", Латвия) и 1 мкл (200 ед.) обратной транскриптазы H-MinusTM M-MuLv ("Fermentas"). Смесь инкубировали 30 мин при 40°С. Реакцию останавливали нагреванием при 95°С в течение 10 мин. Для определения эффективности реакции ОТ-ПЦР-РВ и ПЦР-РВ нами был использован метод кратных разведений кДНК, полученной из мРНК форменных элементов крови контрольных мышей. Эффективность оценивалась по формуле: E = 10[-1/5], где E - эффективность реакции, 5 - величина, зависящая от угла наклона линии регрессии кратных (порядковых) разведений кДНК тканей контрольных мышей [13].
Ct
кДНК, нг
Рис. 1. Калибровочная кривая для определения эффективности реакции ПЦР-РВ методом кратных разведений. Пунктир - аппроксимация графика линейной функцией (регрессия).
Для оценки относительного количества копий мтДНК в клетках крови нами использовалась формула R = 2-AACt.
Эффективность реакции ПЦР-РВ для ядерного гена gapdh, определенная по формуле E = 10[-1/s], равна 1.83.
Наличие фрагментов мтДНК в сыворотке крови мышей определяли методом ПЦР с визуализацией ее продукта в агарозном геле. Реакцию проводили в объеме 20 мкл, в буфере, содержащем 10 ммоль/л трис-HCl с pH 8.3, 50 ммоль/л KCl, 0.2 ммоль/л dNTPs, 1.6 ммоль/л Mg2+, 250 нмоль каждого праймера, 2 ед. Taq-ДНК-по-лимеразы. Амплификацию фрагментов проводили с праймерами MC1F и DlR, указанными в таблице, при 45 циклах по следующей программе: денатурация: 94°С (1 мин), отжиг 60°С (1 мин), элонгация 72°С (2 мин) на амплификаторе "Тер-цик" (Россия). Визуализацию полученных продуктов ПЦР осуществляли после их электрофо-ретического разделения в 2%-ном агарозном геле в буфере, содержащем 20 ммоль/л трис-ацетата, с рН 8.0, 1 ммоль/л ЭДТА. Гель окрашивали бромистым этидием и фотографировали.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для определения количества копий мтДНК в клетках крови мышей мы применяли метод ПЦР-РВ с использованием в качестве референтного (house-keeping) ядерного гена gapdh. В данном методе значение критического цикла Ct (цикла, при котором реакция ПЦР выходит на экспоненциальную фазу) отражает количество ДНК в ПЦР в обратно пропорциональной зависимости,
т.е. чем меньше количество ДНК в пробе, тем выше значен
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.