ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2007, том 413, № 4, с. 553-556
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.112
ВАКЦИНА комбиВИЧвак, СОДЕРЖАЩАЯ ПОЛИЭПИТОПНЫЕ В- И Т-КЛЕТОЧНЫЕ ИММУНОГЕНЫ ВИЧ-1
© 2007 г. Л. И. Карпенко, С. И. Бажан, А. М. Ерошкин, Л. Р. Лебедев, Р. В. Ужаченко, Н. А. Некрасова, О. А. Плясунова, П. А. Белавин, С. В. Серегин, Н. К. Данилюк, Е. Д. Даниленко, Б. Н. Зайцев,
В. И. Масычева, А. А. Ильичев, академик РАН |Л. С. Сандахчиев
Поступило 21.11.2006 г.
Задача создания вакцины против ВИЧ-инфекции имеет чрезвычайно актуальное значение, поскольку это самый надежный способ остановить эпидемию СПИДа, которая распространяется угрожающими темпами. Более 20 лет над решением этой задачи работают многие исследователи разных стран. Трудность создания вакцины против СПИДа связана с высокой вариабельностью вируса, его способностью адаптироваться к давлению иммунной системы и индуцировать иммунопатологию, а также отсутствием моделей инфекции на животных [1].
В основу нашей работы был положен один из наиболее обещающих подходов, связанный с идентификацией Т- и В-клеточных эпитопов в белках вируса и созданием на их основе синтетических полиэпитопных вакцин [2-5]. В данной работе представлены результаты нашей работы по конструированию и доклиническому исследованию комбинированной вакцины комбиВИЧвак, объединяющей два искусственных полиэпитопных иммуногена. Один из них - полиэпитопный белок TBI, другой - ДНК-вакцина (плазмида pcDNA-TCI), кодирующая полиэпитопный имму-ноген TCI.
Белок TBI (T- and B-cell epitopes containing immunogen) был сконструирован в виде полипептида с заранее заданной третичной структурой, в основу которой положен известный пространственный мотив - четырехспиральный пучок. Его аминокислотная последовательность включает четыре Т-клеточных эпитопа (для хелперных и/или цито-токсических Т-лимфоцитов) и пять В-клеточных нейтрализующих эпитопов из белков Env и Gag ВИЧ-1. У мышей и обезьян, иммунизированных рекомбинантным белком TBI, регистрируется по-
Федеральное государственное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор", Кольцово Новосибирской обл.
явление специфических антител, обладающих ви-руснейтрализующей активностью [6, 7].
Полиэпитопный белок TCI (T-cell immunogen) содержит более 80 оптимально отобранных эпитопов (как CD8+ CTL, так и CD4+ Th). В состав TCI были включены эпитопы из основных вирусных белков Env, Gag, Pol и Nef, которые являются высоко консервативными для трех основных субтипов ВИЧ-1 (А, В, С). Ген, кодирующий полиэпитопный иммуноген TCI, был встроен в векторную плазмиду pcDNA3.1 [8]. Полученная ДНК-вакцина pcDNA-TCI индуцировала вирусспецифиче-ский Т-клеточный и гуморальный иммунный ответ [9-12].
Вакцина комбиВИЧвак представляет собой искусственные частицы, диаметром от 40 до 100 нм (рис. 1), в центре которых находится ДНК-вакцина pcDNA-TCI, а на поверхности - гибридный белок TBI, конъюгированный с полиглюкином. Таким образом, частицы комбиВИЧвак по своим размерам сравнимы с величиной таких вирусов, как вирусы полиомиелита и полиомы, и прибли-
нм
6 ■ 103
4 ■ 103
2 ■ 103
0 2 ■ 103 4 ■ 103 6 ■ 103 нм
Рис. 1. Изображение вакцины комбиВИЧвак, полученное методом атомно-силовой микроскопии.
logio титр 7 6 5 4 3
(а)
rii
□ Контроль
□ комбиВИЧвак
2- И
п 1 , г
и
Л
п
ril
jn
(б)
я ^
\к\
ril
rii
В
(в)
ii
14 28 35 42 62 Сутки после иммунизации
Рис. 2. Титры анти-IgG-антител на 14, 28, 35, 42 и 62-е сутки после иммунизации мышей комбиВИЧвак (опытная группа) и 0.9% NaCl (контрольная группа). При анализе сывороток в качестве антигена были сорбированы TBI (а), лизат ВИЧ-1ЕуК (б) и реком-бинантные белки ВИЧ-1 коммерческой тест-системы "комбиБест анти-ВИЧ-1,2" (Вектор-Бест, Россия) (в). Данные представлены как среднее значение титра ± стандартное отклонение (n = 5).
Количество IL-2- продуцирующих клеток на 105 спленоцитов
к0г «35 30 25 20 15 10 5 0
□ комбиВИЧвак
□ ВПЧ-рсРКА
Количество IL-4- продуцирующих клеток на 105 спленоцитов
(б)
400 350 300 250 200 150 100 50 0
Количество IFN- у-продуцирующих клеток на 105 спленоцитов
160 140 120 100 80 60 40 20 0
(в)
N15 + N16 GST-TCl Контроль (EHEC) Антигены
жаются к размерам ВИЧ-1 (рис. 1). Такие размеры позволяют значительно повысить иммуноген-ность белка TBI, который представлен во множестве копий на поверхности частицы. Кроме того, оболочка из полиглюкина защищает ДНК-вакцину от действия нуклеаз и способствует повышению иммуногенности ДНК-вакцины за счет повышения вероятности захвата антигенпрезенти-рующими клетками.
Результаты нашего исследования показали, что полиэпитопные иммуногены TBI и TCI в составе вакцины комбиВИЧвак эффективно индуцируют вирусспецифический гуморальный и клеточный ответы (рис. 2, рис. 3). Важно отметить, что, являясь полностью искусственным иммуноге-ном, белок TBI в составе вакцины комбиВИЧвак индуцирует у иммунизированных мышей выработку антител, которые узнают как рекомби-нантные, так и природные антигены ВИЧ-1 (рис. 2). Очевидно, что наибольший титр антител был получен при использовании в качестве антигена гомологичного белка TBI (рис. 2).
Рис. 3. Исследование цитотоксической активности спленоцитов животных, иммунизированных комбиВИЧвак (опытная группа) и ВПЧ-pcDNA3.1 (контрольная группа). Ответ С^ оценивали по выявлению 1Ь-2- (а), ^-4- (б) и Ш^-продуцирующих (в) спленоцитов в реакции ELISpot у иммунизированных мышей BALB/c. Селезенки мышей (п = 5) из каждой группы были объединены в одну смесь. Для специфической стимуляции продукции цитокинов суспензией спленоцитов использовали рекомбинантный белок gst-TCI и смесь двух входящих в него пептидов N15 (DRVIEVVQGAYRAIR - эпитоп из белка gp41) и N16 (KQПNMWQEVGKAMYA - эпитоп из белка gp120). В качестве негативного контроля использован полипептид ЕНЕС. Результаты представлены как среднее цитокинпродуцирующих клеток на 105 спленоцитов.
Одним из основных показателей эффективности вакцины является способность индуцировать антитела, которые могут не только узнавать, но и нейтрализовать вирус. При анализе нейтрализующей активности сывороток рассчитывался индекс нейтрализации (ИН) в соответствии с [13]. Наши результаты показали, что сыворотки мышей, иммунизированных комбиВИЧвак, эффек-
ВАКЦИНА комбиВИЧвак Таблица 1. Оценка вируснейтрализующей активности сывороток
Сыворотка Индекс нейтрализации*, %
разведение сыворотки 1/10 разведение сыворотки 1/50
Объединенная сыворотка иммунизированных комбиВИЧвак мышей 81.90 75.60
ВИЧ-инфицированного человека (СПИД-центр) 99.41 77.83
: Индекс нейтрализации рассчитывали по формуле: ИН = (ОП
ОПконтрольн. клеток) 100% [13].
негатив. сыворотки
ОП
тестируемой сыворотки
)/(ОЦ
негатив. сыворотки
тивно подавляли вирусную репликацию в системе in vitro на культуре клеток МТ-4, инфицированных вирусом ВИЧ-1ЕУк (табл. 1). Индекс нейтрализации этих сывороток был сопоставим с ИН сыворотки, полученной от ВИЧ-инфицированного человека. Таким образом, кандидатная вакцина комбиВИЧвак индуцирует высокий гуморальный ответ, причем антитела высокоспецифичны, они не только распознают антигены ВИЧ-1, но и способны нейтрализовать вирус в системе in vitro. Все эти данные свидетельствуют о том, что В-клеточные эпитопы в составе частиц комбиВИЧвак доступны для узнавания В-клет-ками и конформационно близки природным эпи-топам ВИЧ-1 белков.
Кроме того, вакцина стимулирует и CTL-от-вет, что было показано в трех различных тест-системах ELISpot (INF-gamma, IL-2 и IL-4) (рис. 3). Использование для рестимуляции спленоцитов in vitro как полноразмерного белка TCI, так и отдельных эпитопов, входящих в его состав (пептиды N15 и N16), указывает на то, что при ДНК-иммунизации осуществляются все стадии, необходимые для доставки целевого иммуногена иммунной системе, а именно: экспрессия гена TCI, процессинг целевого белка, представление полученных пептидов (детерминант) CD8+ лимфоцитам (CTL) совместно с МНС I класса. Так как в состав TCI были включены эпитопы, которые являются консервативными среди трех основных субтипов ВИЧ-1 (А, В, С), и включают последовательности из основных вирусных белков Env, Gag, Pol и Nef, это позволяет надеяться, что кандидатная вакцина комбиВИЧвак будет эффективно работать против генетически измененных вариантов ВИЧ-1 путем индукции CD8+ CTL, специфичных к консервативным Т-клеточным эпито-пам.
Исследование токсичности комбиВИЧвак показало, что однократное и многократное внутримышечное введение вакцины комбиВИЧвак мышам в дозе, предполагаемой для введения человеку и 5-кратно ее превышающей, не вызывало существенных или длительно сохраняющихся изменений физиологических, гематологических и биохимических показателей животных. Препарат
при однократном введении не вызывал нарушения микроструктуры внутренних органов, многократные инъекции приводили к усилению предсуще-ствующих воспалительных процессов в печени. В месте введения вакцины не зарегистрировано патологических изменений.
В ходе изучения иммунологической безопасности комбиВИЧвак было установлено, что вакцинный препарат не обладал способностью индуцировать аутоиммунную патологию и ослаблять резистентность организма к инфекции, не вызывал развития общей анафилактической реакции. В то же время следует учитывать вероятность кожной сенсибилизации и снижения под действием комбиВИЧвак клеточного иммунного ответа на неродственный антиген.
Таким образом, кандидатная вакцина комбиВИЧвак обладает рядом уникальных свойств. Она объединяет В- и Т-клеточные иммуногены в одной конструкции, один из которых является белком, а другой - ДНК-вакциной. Вакцина индуцирует как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ. Эпитопы, входящие в состав поли-эпитопных иммуногенов, являются консервативными среди субтипов А, В, С и представлены разными белками ВИЧ-1. Вакцина комбиВИЧвак может рассматриваться не только как профилактическая, но и как терапевтическая, поскольку индуцирует CTL, способные уничтожать инфицированные клетки-мишени. Доклинические испытания вакцины показали, что комбиВИЧвак не вызывает выраженных или
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.