ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 5, с. 770-780
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 581.1:581.032:539.233
ВАКУОЛЯРНЫЙ СИМПЛАСТ* И МЕТОДИЧЕСКИЙ ПОДХОД К КОНТРОЛЮ САМОДИФФУЗИИ ВОДЫ МЕЖДУ ВАКУОЛЯМИ
СОСЕДНИХ КЛЕТОК В КОРНЕ
© 2007 г. Г. А. Великанов
Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук, Казань
Поступила в редакцию 09.02.2007 г.
На современном этапе исследований возникли новые представления о структурно-функциональной организации транспортной системы высших растений. В частности, предполагается существование в растительной ткани не только классического (цитоплазматического) симпласта, но и еще одного надклеточного континуума, образованного вакуолями соседних клеток с участием десмотрубочек (второго транспортного канала в плазмодесмах). В настоящей работе представлен и экспериментально верифицирован методический подход к контролю самодиффузии молекул воды между вакуолями соседних клеток в корне кукурузы (Zea mays L.) методом ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля, основанный на том, что при больших временах наблюдения самодиффузии, когда молекулы воды апопласта и цитоплазмы уже отрелаксировали и фактически не принимали участия в формировании сигнала протонного эха, изменения наклона начального участка диффузионного затухания не зависят от изменений водопроницаемости вакуолярной мембраны, а контролируются исключительно изменениями водопроницаемости межвакуолярного пути по десмотрубочкам.
Zea mays - корни - плазмодесмы - десмотрубочки - вакуолярный симпласт - водопроницаемость - ЯМР
ВВЕДЕНИЕ
К настоящему времени, после выполнения ряда работ на конфокальном микроскопе с использованием флуоресцентных красителей и нефиксированного растительного материала, не осталось сомнения в том, что мембранная структура, расположенная в центре поперечного сечения плазмодесм, может находиться в состоянии полой трубочки, способной соединять в единый надкле-точный континуум внутренние пространства эн-доплазматических сетей соседних клеток. Достаточно убедительный обзор соответствующих публикаций различных авторов можно найти в монографии [1, с. 25-32]. В этой же монографии и предшествующих ей работах автора, на основе эндосимбиогенетической гипотезы происхождения эукариот было представлено большое количество фактов, непротиворечиво объясняющихся
* Вакуолярный симпласт - термин, предлагаемый автором.
Сокращения: ЯМР ИГМП - ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля, ДЗ - диффузионное затухание эха, КСД (О, -Оэфф) - коэффициент самодиффузии. Адрес для корреспонденции: Великанов Геннадий Алексеевич. 420111 К азань, а/я 30. Казанский институт биохимии и биофизики Казанского НЦ РАН. Факс: 007 (843) 238-75-77; электронная почта: velikanov@mail.knc.ru
тем, что внутриклеточные органеллы - хлоро-пласты и митохондрии - заключены в единую систему эндомембран, организующую надклеточ-ный континуум, который предлагалось называть эндопластом. При этом центральная вакуоль клеток, по представлению Гамалея, является составным элементом эндопласта, т.е. вакуолярная мембрана (тонопласт) входит в состав единой эн-домембранной сети растительной клетки, а между вакуолями соседних клеток существует свободная диффузия воды и ассимилятов [1]. Однако такое представление нельзя признать окончательно закончившим свое существование в разряде гипотез. Тем более, что многие аспекты минерального питания [2] и/или транспорта ассимилятов в растении [3] достаточно аргументированно рассматриваются с позиции того, что центральная вакуоль - замкнутый внутриклеточный ком-партмент.
В предыдущем нашем исследовании [4] с использованием непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии было отчетливо показано присутствие маркера тонопласта - пирофосфатазы в местах "прохождения" плазмодесм через клеточные стенки. Это обстоятельство может быть важным доводом в пользу представления о том, что де-смотрубочка как элемент эндоплазматической мембранной сети может одновременно быть элементом вакуолярной мембраны. В работах [4, 5]
мы изучали также особенности ограниченной самодиффузии молекул воды в корнях проростков кукурузы (в направлении, параллельном радиальному сечению корня) импульсным методом ЯМР в нормальных условиях и в условиях ингибирова-ния дыхания в присутствии азида натрия. При временах наблюдения диффузии достаточных для того, чтобы молекулы воды продиффундировали на расстояния, превышающие размеры клеток, а молекулы воды апопласта и цитоплазмы отре-лаксировали и практически не принимали бы участия в формировании сигнала протонного эха, в нормальных условиях между вакуолями соседних клеток была выявлена пространственно не ограниченная самодиффузия молекул воды, которая купировалась в пределах вакуолей под влиянием азида натрия. При этом водопроницаемость тоно-пласта в обоих вариантах опыта оставалась неизменной.
Полученные в работах [4, 5] результаты свидетельствовали о наличии в исследуемом объекте межклеточного континуума, образованного вакуолями соседних клеток. Не имея в своем распоряжении методических оснований для того, чтобы разрешить все проблемы, связанные с доказательством присутствия внутри такого континуума митохондрий и хлоропластов (для фотосинте-зирующих тканей), к чему обязывало бы нас принятие предложенного Гамалеем понятия об эндопласте, мы назвали такой континуум "вакуо-лярным симпластом", ориентируясь лишь на то, что мы реально выявили и способны контролировать.
После выхода в свет работ [4, 5] к нам поступило много вопросов, свидетельствующих как о большом интересе к проблеме, так и о том, что в этих работах мы не уделили достаточного внимания разъяснению и обоснованию соответствующего методического подхода.
Настоящая статья имеет методическую направленность и восполняет этот пробел. Однако сразу договоримся: на сегодняшний день между исследователями практически не существует разногласий по поводу того, что эндоплазматиче-ские пространства соседних клеток во многих растительных тканях сообщаются между собой посредством десмотрубочек, поэтому проблема существования высокой проницаемости в пространстве между центральными вакуолями в значительной степени может быть сведена к поиску контакта вакуоли с эндоплазматическим пространством и познанию механизма такого контакта. Нельзя исключать временный (импульсный или квантовый) характер искомого контакта, а в качестве его реального механизма может рассматриваться, например, механизм динамичного высокопроницаемого "щелевого" контакта (gap junction) мембран эндоплазматического ре-
тикулума и тонопласта. Как бы то ни было в действительности, в настоящей работе речь пойдет об усредненной по времени и по объему образца самодиффузии молекул воды между вакуолями соседних клеток во всасывающей зоне корня, а выявленную регулируемую межвакуолярную связь не через тонопласт в настоящей статье будем условно называть межвакуолярной связью по десмотрубочкам.
МЕТОДИКА
Объектом исследования в работах [4, 5] и в настоящей работе служили корни 4 -дневных этиолированных проростков кукурузы (Zea mays L.). Семена вымачивали в течение 8 ч под проточной водой, затем помещали в увлажненную, свернутую рулоном фильтровальную бумагу и выращивали в термостате при 25°С на дистиллированной воде с добавкой 100 мкМ CaCl2. Для исследования брали отсеченные сегменты корня длиной 7 мм из зоны всасывания, расположенной далее 8 мм от кончика корня. Отсеченные сегменты предварительно выдерживали 2 ч в дистиллированной воде и аэрируемых условиях (на качалке), чем достигалось снятие стрессовой реакции транспортной системы корня на его отсечение.
Для изучения самодиффузии молекул воды использовали метод спинового эха ЯМР (на протонах) с импульсным градиентом магнитного поля (ЯМР ИГМП). Исследование проведено на базе оригинального ЯМР-диффузометра-релаксомет-ра с частотой резонанса 16 МГц, созданного в Казанском институте биохимии и биофизики Каз-НЦ РАН [6]. Сегменты корней помещали в ЯМР-датчик так, что градиент магнитного поля был направлен параллельно радиальному сечению корня, что позволяло регистрировать самодиффузию воды в этом направлении. Процесс восстановления (релаксации) продольной намагниченности в корне регистрировали способом, описанным в [7]. Управление прибором, а также обработку диффузионных затуханий и релаксационного затухания сигнала эха, осуществляли на компьютере. Регистрацию вели при температуре 25°С.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Основы методического подхода
Некоторые атомные ядра (ХН, 13С, 19F, 31Р и др.) кроме заряда и массы характеризуются еще и магнитным моментом (спином). Если образец, содержащий ядра с отличным от нуля спином, поместить в постоянное магнитное поле, то в результате взаимодействия спинов с этим внешним полем в образце возникнет макроскопическая намагниченность. Вектор такой намагниченности будет параллелен внешнему полю и будет представлять собой векторную сумму магнитных
A/Ao
t, c
Рис. 1. Релаксация продольной (7\) намагниченности протонов воды (релаксационное затухание эха) в сегментах корней кукурузы, соответствующая одному из повторов опыта, статистически обработанный результат анализа которого показан в третьей строке таблицы. Прямая линия соответствует теоретическому значению медленной компоненты релаксационного затухания с параметрами Тц = 920 мс и населенностью Р1 = 83%.
моментов (спинов) отдельных ядер, прецессирую-щих (т.е. с воронкообразным колебанием оси) вокруг внешнего поля (Н0) с частотой, равной произведению уН0, где у - гиромагнитное отношение ядра (физическая константа). (Здесь уместно отметить, что прецессия спина в магнитном поле по своей природе имеет аналогию с прецессией быстро вращающегося волчка в гравитационном поле.) Если теперь на образец через охватывающую его катушку из металлической проволоки, ориентированную перпендикулярно полю Н0, подать радиочастотный импульс определенной длительности на частоте резонанса (уН0) интересующих нас ядер (протонов, для нашего случая с целевой установкой на контроль водопроницаемости), то вектор намагниченности образца может быть повернут в направлении оси катушки. При этом в сам
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.