= ГЕНЕТИКА =
УДК 577.333:575.224:616-006.2:595.773.4
ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ДЕЙСТВИЯ ЭКЗОГЕННОГО АНТИОКСИДАНТА НА ВЫЖИВАЕМОСТЬ: МОДЕЛИРОВАНИЕ НА ЛИНИЯХ ДРОЗОФИЛЫ, РАЗНЫХ ПО ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТИ ЖИЗНИ И ДОЗЕ ОНКОСУПРЕССОРА l(2)gl
© 2010 г. Н. Я. Вайсман*, М. Д. Голубовский**, Н. К. Зенков***, Е. Б. Меньшикова***, В. Н. Пашин*
*Институт цитологии и генетики СО РАН, 630090 Новосибирск, просп. Академика Лаврентьева, 10 **Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley, CA, California 94720, USA ***Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН, 630117Новосибирск, ул. Тимакова, 2
E-mail: weisman@bionet.nsc.ru Поступила в редакцию 03.04.2009 г.
Для уменьшения возрастных нарушений и продления жизни человека и животных применяют экзогенные антиоксиданты и геропротекторы. Однако воздействие антиоксидантов на продолжительность жизни носит вариативный характер и требует детального анализа. В работе изучали особенности действия на продолжительность жизни Drosophila melanogaster нового синтетического фенольного антиоксиданта ТС-13. Исследовали эффект действия ТС-13 на показатели продолжительности жизни дрозофил в двух контрастных по этому признаку линиях. Кроме того, проверяли эффект действия антиоксиданта на фоне гетерозиготности по нулевому аллелю онкосупрессора l(2)gl. Обнаружено разнонаправленное действие ТС-13 на продолжительность жизни, характер которого зависел от дозы антиоксиданта, генотипа линий и пола дрозофил. ТС-13 в концентрации 0.2% во всех линиях не оказывал воздействия на продолжительность жизни или даже ухудшал выживаемость; тогда как в концентрации 1% антиоксидант оказывал позитивное действие на продолжительность жизни у обоих полов в долгоживущей линии. Воздействие антиоксиданта на животных линии с уменьшенной дозой онкосупрессора l(2)gl приводило к понижению продолжительность жизни.
Одним из важных факторов появления возрастных нарушений у живых организмов, раннего старения и болезней является снижение эффективности системы эндогенных антиоксидантов. При этом происходит усиление продукции активных форм кислорода (АФК), накопление продуктов свобод-норадикального окисления и, как следствие, нарушение физиологических функций клеток и тканей (Нагтап, 2001). Для уменьшения возрастных нарушений и продления жизни человека и животных часто применяют экзогенные антиоксиданты и геропротекторы (Зенков и др., 2007; Анисимов и др., 2008). Однако модельные опыты, в особенности на дрозофиле, показали, что характер влияния антиок-сидантов на продолжительность жизни (ПЖ) зависит от генотипа животных, их пола и условий среды. Так, в линиях с относительно низкой исходной ПЖ эффект добавок к питательной среде дрозофил гормона мелатонина, обладающего свойствами антиоксиданта и геропротектора, был позитивным. Воздействие гормона на мух с высокой ПЖ было токсичным и негативным и понижало ПЖ в экспериментальной группе примерно на 10% (12тау1оу ОЬикЪоуа, 1999). Скармливание личинкам дрозофилы эпиталамина, который подавляет
окисление липидов в тканях дрозофилы, воздействовало по-разному на ПЖ самок и самцов: у взрослых самок скорость старения снижалась в 2 раза, жизнь существенно продлевалась, а у самцов достоверного эффекта на показатели ПЖ не наблюдали (АпМтоу в1 а1., 1997).
Подобные же полярные по знаку эффекты обнаружены при исследовании воздействий витаминов А (ретинол), С (аскорбиновая кислота) и Е (а-токо-ферол) на ПЖ дрозофилы в различных стрессовых условиях (ВаИаёогат в1 а1., 2008). Наибольшую ан-тиоксидантную активность обнаружили у а-токо-ферола. Он увеличивал среднюю и максимальную ПЖ у дикого типа в условиях избытка прооксидан-тов и у мутантов с делецией по гену супероксиддис-мутазы СОД1 в нормальных условиях. В нормальных условиях ретинол продлевал ПЖ у мутантов по гену СОД1, а аскорбиновая кислота — у нормальных мух. В условиях окислительного стресса оба витамина укорачивали ПЖ, проявляя явную проокси-дантную активность. Более того, витамин С усиливал токсичность железа и увеличивал его пул в теле взрослой мухи (ВаИаёогат в1 а1, 2008).
Действие антиоксидантов зависит от их физических и химических свойств. Обладающие антиокси-
дантной активностью природные полисахариды порфираны с разным молекулярным весом при ежедневном добавлении в пищу D. melanogaster значительно увеличивали жизнеспособность и ПЖ по сравнению с контролем, причем более тяжелые молекулы действовали в нормальных условиях, а легкие порфираны только при тепловом стрессе (Zhao et al., 2008).
Интересным для исследования представляется новый класс антиоксидантов, которые обладают высокой гидрофильностью и бифункциональным антиоксидантным действием, так как, помимо фе-нольной ОН-группы, содержат серосодержащие фрагменты, проявляющие антипероксидную активность. В разных экспериментальных системах были изучены антирадикальные и антиокислительные свойства таких синтезированных соединений (Просенко и др., 2001; Зенков и др., 2007).
Вариативность в действии антиоксидантов диктует необходимость детального анализа их воздействий на модельные объекты (мышь, дрозофила). Для этого могут служить линии с заведомо разным уровнем ПЖ, а также линии, несущие варианты жизненно важных генов, существенно влияющих на ПЖ в норме и в условиях стресса. За последние 10 лет у дрозофилы и у круглого червя Caenorhabditis elegans обнаружены гены, резко повышающие ПЖ. В то же время некоторые из этих генов обеспечивают устойчивость к действию прооксидантов — в линиях с мутациями гена супероксиддисмутазы животные имеют более высокую ПЖ (Lin et al., 1998).
Перспективной модельной системой для исследования связи между действием антиоксидантов, эндогенными АФК и ПЖ может быть исследованная нами в течение ряда лет генетическая система с использованием мутаций гена-онкосупрессора l(2)gl. Животные, гетерозиготные по делеции гена l(2)gl, имеют пониженную ПЖ при нормальной температуре, но увеличенную ПЖ в условиях температурного стресса (Golubovovsky et al., 2006; Вай-сман и др., 2007; Вайсман, Голубовский, 2009). Этот эволюционно консервативный ген, который кодирует белок цитоскелета p127, связан с рядом сигнальных путей, определяющих характер клеточного деления и ответа на стресс, включая апоптоз (Arqui-er et al., 2001; Bilder, 2004; Brumby, Richardson, 2005; Grzeschik et al., 2007). Инактивация гена l(2)gl приводит к онкогенной трансформации нейробластов и клеток имагинальных дисков (Gateff et al., 1977).
В работе ставили следующие цели: 1) сравнить характер действия разных доз нового фенольного антиоксиданта ТС-13 (Зенков и др., 2007) на выживаемость животных в контрастных по ПЖ линиях при добавлении антиоксиданта в корм; 2) изучить половую специфичность влияния антиоксиданта в двух контрастных по ПЖ линиях; 3) установить, как уменьшение дозы онкосупрессора l(2)gl действует на выживаемость и динамику ПЖ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали инбредные линии D. melanogaster из фонда лаборатории генетики популяций Института цитологии и генетики СО РАН. Две нормальные линии — Canton S (CS) и Oregon R (OR) и линию lgl558OR/Cy, которая содержит в гетерозиготном состоянии рецессивную летальную мутацию опухолевого супрессора, гена lethal(2)giant larvae — (l(2)gl), аллель lgl558 (Су—доминантный маркер Curly в хромосоме, свободной от летали).
Для проведения опыта размножали линии при нормальной температуре 25°С и затем под бинокулярной лупой отбирали самок и самцов каждой линии в течение суток после вылета имаго. Для отбора животных наркотизировали эфиром. Рассаживали отобранных дрозофил в пробирки с питательной средой, до 50 мух в каждую. Самок содержали отдельно от самцов.
Исследование по воздействию на ПЖ экзогенного антиоксиданта ТС-13 проводили при температуре 25°С. В вариантах опыта анализировали до 500 животных. Раствор антиоксиданта в двух концентрациях — 1% и 0.2% наносили микродозатором по 10 мкл на поверхность свежей питательной среды в пробирке. Каждые три дня мух пересаживали на свежий корм с добавлением антиоксиданта и вели регистрацию смертности вплоть до завершения цикла жизни у всех мух линии. Контрольных животных содержали на питательной среде без добавления антиоксиданта.
Антиоксидант ТС-13 (3-(3'-трет-бутил-4'-гид-роксифенил) пропилтиосульфонат натрия, химическая формула С13H19O4S2Na) — тиосульфонат из числа вновь синтезированных серосодержащих высоко гидрофильных фенольных соединений с антиокислительной и антирадикальной активностью, был получен на кафедре химии в Новосибирском государственном педагогическом университете (Зенков и др., 2007).
Для определения достоверности различий в опытных и контрольных выборках дрозофил между средними значениями ПЖ применяли критерий Стьюдента (Фишер, 1958), между кривыми выживаемости животных — логранговый тест (Bland, Alt-man, 2004).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Антиоксидант ТС-13 добавляли к диете дрозофил трех разных генотипов — двух нормальных линий CS и OR и мутантной линии lgl558OR/Cy. Были рассчитаны следующие величины ПЖ (таблица): средние значения ПЖ (m), стандартные ошибки средних значений ПЖ (5), разности между контрольными и опытными средними значениями ПЖ (mk - mo, %), значения Т50, Т90 и Т90/Т50 (Т50 и Т90 — время гибели 50 и 90% животных, соответ-
Параметры, характеризующие продолжительность жизни Б. melanogaster двух нормальных линий и линии с уменьшенной дозой онкосупрессора при действии двух концентраций антиоксиданта ТС-13 и в контроле
Линия Вариант опыта п Ш ± 5
OR Контроль 289 43.7 ± 0.7
1% 385 42.7 ± 0.7
0.2% 450 43.6 ± 0.6
ся Контроль 306 58.2 ± 1.0
1% 322 62.4 ± 1.0*
0.2% 312 56.1 ± 1.1
558OR Контроль 190 41.3 ± 0.9
1% 417 40.7 ± 0.4
OR Контроль 294 39.8 ± 0.7
1% 328 40.5 ± 0.6
0.2% 488 38.0 ± 0.7
ся Контроль 272 46.8 ± 1.1
1% 330 50.8 ± 1.0*
0.2% 287 42.8 ± 1.2*
558OR Контроль 188 43.1 ± 0.5
1% 407 39.6 ± 0.5*
Шк
то, %
Время гибели, сут
50% (Т50) 90% (Т90)
Т90/Т50
Мах ПЖ
Самки
-2.3 -0.2
+6.7 -3.7
-0.6 Самцы
+1.7 -4.7
+7.9 -9.3
-8.8
51 48 48 63 69 63 48 45
45 45 42 51 57 51 45 42
51 54 51 75 78 75 51 48
48 45 45 66
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.