ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2014, том 61, № 4, с. 536-545
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ КЛЮЧЕВЫХ БИОХИМИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ПРИ ДЕФИЦИТЕ НИТРАТА И ИЗБЫТОЧНОМ НАКОПЛЕНИИ ГЛЮКОЗЫ В СТАРЕЮЩИХ ЛИСТЬЯХ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ © 2014 г. А. К. Романова, Н. С. Новичкова, А. Р. Игнатьев, И. А. Найдов, В. А. Полякова
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино, Московская обл.
Поступила в редакцию 01.03.2013 г.
Изучали динамику параметров старения листьев сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) в фазе вегетативного роста, выращенной при нормальном уровне нитрата (N) и при его дефиците (Деф^. Ускоренное старение инициировали 41-часовым экспонированием высечек из листьев на поверхности воды со сменой темноты и света. После роста при ДефN уменьшалось число листьев и их средняя площадь; после выдерживания высечек из тех же листьев на воде содержание растворимых углеводов (рУгл) и особенно глюкозы по сравнению с N-контролем резко увеличивалось, тогда как содержание белка (рБел) и активность РБФК/О заметно уменьшались, что характерно для проявления негативного гексокиназного (НХК1) эффекта глюкозы. Темпы снижения содержания рБел при старении листьев, рассчитываемые на один ярус, были меньше темпов снижения активности РБФК/О. Снижение содержания рБел и активности РБФК/О во всех ярусах листьев при совместном действии ДефN и экспонировании на воде в среднем было больше, чем в каждом из этих вариантов по отдельности, но меньше, чем при их суммарном действии. Обсуждается ограниченность предполагаемого механизма трансдукции сигналов при ДефN и избытке глюкозы и их взаимодействия в стареющих листьях сахарной свеклы, а также возможность использования отношения содержания рУгл и рБел для оценки проявления негативного гексокиназного эффекта глюкозы.
Ключевые слова: Beta vulgaris — сигнальные эффекты — дефицит нитрата — растворимые углеводы — глюкоза — белок — рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилаза (РБФК/О)
DOI: 10.7868/S0015330314040150
ВВЕДЕНИЕ
Важнейшие макроэлементы питания растений углерод и азот выполняют трофические, регуля-торные и сигнальные функции, как на уровне клетки, так и на уровне целого растения [1-4]. Представления о молекулярно-биологической природе метаболического сигналинга, в частности ингибирующего действия повышенных концентраций растворимых углеводов на рост и фотосинтез, основаны на многочисленных исследованиях регуляции (feed-back regulation) фотосинтеза конечным продуктом реакционной цепи у водоросли Chlorella [5] и у высших растений [6, 7], например, у проростков сахарной свеклы, росших на искусственной среде [8].
Сокращения: рБел — растворимый белок; рУгл — растворимые углеводы; ДефК — дефицит нитрата; N — норма нитрата; ^ода и Деф^ода — N и Деф^варианты после инкубации высечек из листьев на воде.
Адрес для корреспонденции: Романова Алла Карловна. 142290 Пущино Московской обл., Институтская ул., 2. Институт фундаментальных проблем биологии РАН. Факс: 007 (496) 733-05-324; электронная почта: aromanova27@rambler.ru
В результате анализа и обобщения накопленных данных была сформулирована расширенная концепция о ведущей сигнальной роли углеводов, главным образом глюкозы и сахарозы, регулирующих распределение фотоассимилятов у растений [9]. Растворимые углеводы (рУгл), в отличие от фитогормонов, содержатся в листьях растений в значительных (миллимолярных) количествах. Повышение концентрации С02 в воздухе, происходящее на протяжении последних десятилетий, сопровождаемое увеличением содержания рУгл в листьях растений, послужило дополнительным стимулом для выявления молекулярных механизмов сигнального действия рУгл [10, 11].
Сигнальное действие сахарозы, в отличие от сигнального действия глюкозы, связано с процессами ее активного переноса через мембраны и с дальним транспортом [12] и не имеет прямого отношения к сигнальному глюкозному эффекту, кроме сходства начального пути биосинтеза сахарозы и глюкозы. Глобальное генетическое профи-
лирование транскрипции генов у резушки Таля (АгаЫйор$15 АаНапа), растущей в обычной атмосфере, показало, что глюкоза может влиять почти на 1000 генов, выполняющих самые разнообразные функции, причем 444 из них реагировали позитивно, а 534 — негативно [2]. Негативный сигнальный эффект глюкозы был расшифрован на молекулярном уровне, и после доказательства существования особого изоэнзима гексокиназы (НХК1) как сенсора на глюкозу получил название "гексокиназного негативного эффекта" [10, 11, 13]. Признаки негативного НХК1-эффекта у высших растений обнаруживали в первую очередь по задержке роста проростков на искусственной среде, содержащей повышающиеся концентрации глюкозы при достаточном уровне азотного питания, и по характерным изменениям роста и метаболизма, при действии специфического ингибитора гликолиза 2-дезокси^-глюкозы и др. [10, 11, 13, 14]. Кроме проростков в разных исследованиях были использованы культура клеток, протопласты, срезанные и укорененные листья или плавающие на воде высечки из листьев [11, 13]. Кроме наиболее изученного к настоящему времени А. АаНапа [13], объектами исследования являлись представители и других видов растений, таких как кукуруза, табак, огурцы, марь, рис [11, 15]. Решающую роль в выявлении негативного эффекта НХК1 сыграли генно-инженерные исследования мутантов, с помощью которых удалось отделить негативный глюкозный эффект от эффектов сахарозы и некоторых фитогормонов [13]. Показана возможность сохранения негативного НХК1-эффекта и на пониженном фоне азотного питания [13]. Негативный НХК1-эффект глюкозы у 7-дневных проростков А. АаНапа не перекрывался осмотическим эффектом маннита, и в этом в частности состоит его отличие от стрессов, вызываемых гормональными факторами, такими как АБК или этилен [12].
К настоящему времени обнаружено множество изоэнзимов гексокиназы, локализованных в разных компартментах листа и растения, в том числе и в ядре, выполняющих разные и не всегда идентифицированные функции [12, 16]. Тем не менее, серией генно-инженерных комбинаций было установлено, что изоэнзим НХК1, являющийся главным сенсором на глюкозу, в основном локализован в цитоплазме и, по-видимому, структурно связан с митохондриями [13, 17].
Ускорение старения листьев путем задержки оттока фотосинтатов (в основном после темновой инкубации высечек на воде) и избыточного накопления глюкозы выражалось в задержке синтеза ряда белков фотосинтеза [10, 14]. В качестве мишени действия гексокиназного эффекта чаще всего использовали белок РБФК/О, присутствующий в хлоропластах листьев в наибольших количествах и являющийся прямым показателем
способности растения к автотрофии [18]. Однако истинной причиной негативного эффекта на уровне транскрипции генов, даже у молодых проростков, выращиваемых на искусственной среде и при повышенной концентрации СО2 c добавлением глюкозы, оказалось старение, регистрируемое по появлению гена В-глюкуронидазы (gus) [19].
Знания о механизмах трансдукции сигнала от избытка глюкозы у разных растений, кроме ара-бидопсиса, все еще фрагментарны [2, 13]. Известно, что листья сахарной свеклы могут накапливать сахара в значительных количествах без заметного повреждения фотосинтеза [20]. Однако сведения о регуляции белкового обмена в листьях и роли нитрата в проявлениях негативного гексокиназного эффекта у Beta vulgaris были явно недостаточны.
Ранее с использованием высечек стареющих листьев растений в возрасте не менее 75 дней, плавающих на растворе 0.1 М глюкозы или на воде, при смене периодов света и темноты мы показали снижение содержания растворимого белка (рБел) и потенциальной активности РБФК/О в стареющих листьях, которое совпадало с усиленным накоплением глюкозы и было наиболее отчетливо выражено у листьев, относящихся к фазе старения, тогда как у молодых растений, наоборот, глюкоза могла способствовать накоплению белка, проявляя трофический эффект [21]. Стехиометрия между накоплением глюкозы и снижением содержания рБел отсутствовала, и можно было предполагать, что в старых (донорных) листьях сахарной свеклы, как и у других растений [11], по крайней мере при достаточном снабжении нитратом, негативный сигнальный эффект глюкозы возможен в условиях ускоренного старения. Эти результаты требовали более детального исследования возможностей выявления гексоки-назного эффекта при естественном и ускоренном старении листьев не только при нормальном уровне нитрата, но и при его дефиците.
Некоторые аспекты регуляции метаболизма соединений азота при старении листа, в том числе и сигнальные, детально изложены в обзорах [3, 4, 18]. Значительное количество специальных исследований было посвящено сигнальной функции нитрата и ее связи с сигнальными функциями сахаров [1, 3, 4]. Как при углеводном, так и при нитратном сигналинге исследования вели на всех уровнях, включая все этапы от узнавания эффектора до реализации эффектов на уровне биосинтеза белка. Обширный материал, накопленный молекулярной биохимией и генетикой, демонстрирует потенциальные возможности изменений, которые могут по-разному реализоваться в конкретных условиях in vivo. Предлагаемые интегральные схемы взаимосвязей, охватывающие даже не весь аспект взаимоотношений метаболиче-
ских и фитогормональных сигнальных систем, хотя и приобрели бьльшую информативность в отдельных частях, но оказались малопригодными для понимания проблемы в целом. Требовались новые оценки реальных пулов характерных продуктов углеродного и азотного метаболизма и их изменений в норме и при стрессах для количественной оценки ключевых параметров метаболических путей и их изменений, обеспечивающих как рост растения в нормальных условиях, так и его выживание при стрессах. Значение старения как регуляторного фактора как правило связывали не только с избытком глюкозы и с уровнем азотного питания, но и с соотношением продуктов углеродного и азотного обмена (C/N) [22].
Целью настоящего исследования было выявление возможности проявления негативного гек-сокиназного эффекта в листьях сахарной свеклы, выращенной при нормальном уровне нитрата (контроль, вариант
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.