БИОФИЗИКА, 2011, том 56, вып. 5, с. 840-847
МОЛЕКУЛЯР НАЯ И КЛЕТОЧНАЯ БИОФИЗИКА =
НАНОТЕХНОЛОГИИ in vivo
УДК 577.3
ВАЖНО СТЬ СО ХРАНЕНИЯ БИОФИЗИЧЕСКОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ВЫДЕЛЕННЫХ МИТОХОНДРИЙ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ ИX ФУНКЦИЙ
© 2011 г. М.В. Захарченко, Н.В. Хундерякова, М.Н. Кондрашова
Учреждение Российской академии наук Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН,
142290, Пущино, ул. Институтская, 3 E-mail: mkondrashova23@inbox.ru Поступила в p едакцию 09.06.11 г.
Авторами pазработан способ, позволяющий сохранить митохондриально-ретикулярную сеть в лимфоцитах путем иммобилизации мазка крови на стекле и его инкубации в разработанной, близкой к физиологической, среде. На таких препаратах физиологические ответы дыхания на возбуждение в организме ярко выражены. Выявление ранних реакций митохондрий на патогенные воздействия в организме является актуальной задачей фундаментальных и медицинских исследований, так как они играют ведущую роль в развитии патологических состояний.
Ключевые слова: митохондрии, ультраструктура и функции, сукцинатдегидрогеназа, стресс, тетразолий.
Методы и методология исследований тканевых пр епаратов биохимиками ближе к химическим, чем физическим подходам. Несомненно, что большое внимание должно уделяться со -хр анению нативной ультраструктур ы исследуемых объектов. Стало общепринятым мнение о том, что живая клетка не раствор, а, по удачному выр ажению Н .Г. Е сиповой, скорее аналог твер дого тела. Однако по-прежнему встречают -ся примеры, когда в конкретных биохимических исследованиях не учитывается сохранение на-тивных биофизических характеристик изучаемого объекта. Особенно стойко сохраняется это положение при использовании традиционных, давно принятых методов исследования. И х недостатки, даже очевидные, были пер екры-ты достижением новых успехов, а позже к ним привыкли и перестали обращать на них внимание. В настоящей работе мы проанализир уем такую ситуацию в очень интенсивно исследуемой области изучения дыхания митохондрий (МX) на выделенных препаратах. Благодаря выделению М X из клеток в середине пр ошлого века были достигнуты большие успехи в изучении протекающих в митохондриях химиче-
Сокращения: МХ - митохондрии, МРС - митохондри-ально-ретикулярная сеть, ФН - фосфат неорганический, И С - иммобилизационный стресс, ПСЭ - психоэмоциональный стресс, СДГ - сукцинатдегидрогеназа, КДГ -а-кетоглутаратдегидрогеназа, ЦБХ - цитобио химический.
ских процессов и используемых ими молеку-ляр ных механизмов. Однако позже становится очевидным, что на выделенных тр адиционным способом МX плохо выявляется физиологическая регуляция их функций в организме. П ри-чиной этого является разрушение «нежной» тотальной ультраструктуры, объединяющей МX в клетке в единую сеть с участием эндоплаз-матического ретикулума - митохондриально-ретикулярную сеть (МPC) (см. [1,2]). Тем не менее были достигнуты большие успехи в выяснении механизмов подвижности этой сети, осуществляющейся двумя противоположными процессами - распада и слияния МX [3-6]. Показано, что динамичность сети является о с-новным регулято ром физиологического состояния клеток. Очень интересны новые данные, выявившие защитное адаптационное значения процессов укрупнения М X, их слияния в ответ на умер енные стр ессовые воздействия в пределах физиологического диапазона. При усилении воздействий наблюдается необратимый р аспад МPC. Xочетcя напомнить, что в московском Институте биологической физики АН CCCP, послужившем родоначальником нашего Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН в Пущино, обратимые укрупнение и распад МX были обнаружены еще в 60-е годы А.Л. Шабадашом (см. [1]). На основании упомянутых исследований вопрос о важности сохранения МPC в опытах ех vivo для наблю-
дения ее pаботы in vivo пpедcтавляетcя веcьма актуальным [7]. Неcмотpя на это, измеpения дыxания по-пpежнему пpоводятся традиционным поляpогpафичеcким методом на выделен-нык МX, у котоpыx полноcтью pазpушена организация в М PC. Это обусловлено отcутcтвием дpугого cпоcоба и тем, что использовать для этой цели пер еживающие целые клетки нельзя, так как иx отстояние пp одолжает менятьcя вне оpганизма и не cоxpаняет инфоpмацию о cо-cтоянии, бывшем внутpи него. Поэтому используют пpивычное выделение М X и дыхание, как показатель иx отстояния. Микpо cкопичеcкие же иccледования пpи этом обычно не пpоводятcя и cтpуктуpные изменения не контpолиpуютcя. Оценка cо cтояния М X по дыханию обманчива: пpи более сильном pа cпаде анcамблей М X ско-pоcть дыxания возpаcтает. Обычно это воспри-нимаетcя как пpоявление иx xоpошей сохран-ноcти, однако может являтьcя пеpвым признаком потеpи cоcтояния покоя, как будет обcу-ждено ниже.
В данной pаботе мы xотим пpивлечь внимание к значительноcти pазp ушительного влияния на М X фактоpов, общепpинятыx в биохи-мичеcкиx иccледованияx, и обоcновать способ, позволяющий избежать этиx недоcтатков. Этот способ оcнован на cоxp анении тонкой нативной ультpаcтpуктуpной о pганизации М X в клетке. В cовpеменной физико-xимичеcкой биологии шиpоко pазpабатываютcя теxнологичеcкие пpиемы конcтpуиp ования наномаcштабныx ис-куccтвенныx уcтpойcтв, котоpые обеспечивают повышение эффективноcти иx pаботы. бедует также обpатить внимание на важность OTxp а -нения естественной биофизической ультра-cтpуктуpной оpганизации в отпоставимом масштабе. Вcе это позволит значительно повысить качеcтво исследований и пp иблизить иx к фи-зиологичеcким уcловиям.
НАPУШЕНИЯ БИОФИЗИЧЕ^ОЙ C ТРУКТУРЫ И ФУНКЦИЙ
МИТОXОНДPИЙ П PИ БИОXИМИЧЕCКИX И CCЛЕДОВАНИЯX
Для выделения из клеток МX в виде отдельные гранул пpежде вcего необxодимо раз-pушить нитчатую cтpуктуpу, cвязывающую иx в единую cеть. Pешение этой пр облемы успешно базируется на «трех китах» выделения М X -применении сахарозы, разведения и холода. Если регистрировать последствия выделения только по измерению дыхания, то остается незамеченным, что распад М PC пр иводит и к параллельной потер е возможности наблюдать вне ор га-
низма изменения, происходящие при функционирования МX в организме. Это становится очевидным при микроскопическом наблюдении за динамикой поведения фрагментов МPC -крупных и мелких ансамблей МX, которые удается сохранить в гомогенатах, полученных в измененных условиях по сравнению с традиционными [1,2]. Даже частичное приближение этих условий к условиям в клетке - замена сахарозы на хлористый калий, использование в 10 р аз меньшего разведения ткани в гомоге-нате и измерение пр и температуре 12-15°C -позволяет не только сохранить фрагменты сети, но и наблюдать вне организма как ее распад, так и спонтанную сборку [8,9]. Впервые вне организма выявляется этот по существу физиологический восстановительный процесс, сопровождающий работу МX в организме.
Выбор оптимальных условий основан на выявлении повреждающего воздействия обычно используемых в биохимических исследованиях факторов на сборку и разборку фрагментов сети. Их сопоставление с действием физиологических регуляторных факторов в организме показало, что распад фрагментов сети под воздействием используемых реактивов и условий аналогичен таковому же при действии возбуждающих и повреждающих воздействий в организме. Поэтому амплитуда изменений М X в организме, наблюдаемая ex vivo, сильно уменьшается или вовсе исчезает на органеллах, распавшихся на мелкие ансамбли и гранулы.
Далее представлены примеры действия исследованных факторов на обратимые ультраструктурные изменения биофизической организации МX в сопоставлении с их влиянием на дыхание.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Гомогенат печени крысы получали в среде, содержащей 125 мМ КCl, 10 мМ HEPES, рН 7,2 [10]. Контрольные и опытные пробы гомо-гената (1 мл) хр анили в тер мостатир уемы х ячейках при 2°C или 12°C. Для видеомикр оскопи-ческих измерений 30 мкл гомогената добавляли к 1 мл среды, перемешивали при стандартной скорости в течение 5 мин, помещали в камеру Нейбауэра и микроскопировали с применением техники темного поля.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Влияние сахарозы. Cpеда на основе са харо -зы (или близкого к ней маннита) незаменима при выделении изолир ованных М X и исследовании их биохимических функций. C помощью
Рис. 1. Разрушающее действие сахарозы на МРС. 30 мкл густого гомогената (1:1), приготовленного в среде KCl, перемешивали 5 мин в 970 мкл среды KCl (контроль) или в среде на основе сахарозы (0,25 М ) в течение 1, 2 или 5 мин. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего, n = 4, * - p < 0,05, ** -p < 0,001 относительно контроля. Над диаграммами приведены микроскопические изображения МРС (темное поле) в соответствующих условиях.
установки для морфометрического исследования ансамблей М X можно не только показать сам факт деструктивного действия сахарозы, но и количественно оценить этот процесс. Для этого были проведены эксперименты, в которых исходный гомогенат печени, приготовленный в среде КС1, помещали в ячейку с раствором сахарозы (0,25 М) и перемешивали в течение 1, 2 и 5 мин на магнитной мешалке.
На рис. 1 показано проявление разрушительного действия са хар озы на М РС: помещение препарата всего на 1 мин в среду, содержащую 0,25 М сахарозы, приводит к распаду ансамблей и уменьшению их средней площади на 30%, на 2 мин - более чем в 3,5 раза, а через 5 мин нахождения в среде с сахарозой ансамбли практически полностью распадаются на отдельные М X, а их средняя площадь уменьшается в 5 р аз!
Влияние концентрации гомогената на самосборку фрагментов сети. Ранее мы показали, что обычно используемое большое р азведение гомогената при выделении МX (1:10 и 1:8) приводит к распаду сети на отдельные гранулы. П ри этом полностью прекр ащается спонтанная самосборка сети [8-11].
Поэтому мы используем для исследования процессов самоорганизации МРС концентрированный по белку гомогенат в соотношении ткани и р а створ а К С1 1:1.
Рассыпание сети под воздействием холода.
Нами показано, что обычное проведение исследований на М X при темпер атуре 2-4°С оказывает сильное разрушающее действие на М РС [8-11]. Это обусловлено главным образом деполимеризацией тубулина при этой темп
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.