научная статья по теме ВАЖНОСТЬ СО ХРАНЕНИЯ БИОФИЗИЧЕСКОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ВЫДЕЛЕННЫХ МИТОХОНДРИЙ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ ИX ФУНКЦИЙ Биология

Текст научной статьи на тему «ВАЖНОСТЬ СО ХРАНЕНИЯ БИОФИЗИЧЕСКОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ВЫДЕЛЕННЫХ МИТОХОНДРИЙ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ ИX ФУНКЦИЙ»

БИОФИЗИКА, 2011, том 56, вып. 5, с. 840-847

МОЛЕКУЛЯР НАЯ И КЛЕТОЧНАЯ БИОФИЗИКА =

НАНОТЕХНОЛОГИИ in vivo

УДК 577.3

ВАЖНО СТЬ СО ХРАНЕНИЯ БИОФИЗИЧЕСКОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ВЫДЕЛЕННЫХ МИТОХОНДРИЙ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ ИX ФУНКЦИЙ

© 2011 г. М.В. Захарченко, Н.В. Хундерякова, М.Н. Кондрашова

Учреждение Российской академии наук Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН,

142290, Пущино, ул. Институтская, 3 E-mail: mkondrashova23@inbox.ru Поступила в p едакцию 09.06.11 г.

Авторами pазработан способ, позволяющий сохранить митохондриально-ретикулярную сеть в лимфоцитах путем иммобилизации мазка крови на стекле и его инкубации в разработанной, близкой к физиологической, среде. На таких препаратах физиологические ответы дыхания на возбуждение в организме ярко выражены. Выявление ранних реакций митохондрий на патогенные воздействия в организме является актуальной задачей фундаментальных и медицинских исследований, так как они играют ведущую роль в развитии патологических состояний.

Ключевые слова: митохондрии, ультраструктура и функции, сукцинатдегидрогеназа, стресс, тетразолий.

Методы и методология исследований тканевых пр епаратов биохимиками ближе к химическим, чем физическим подходам. Несомненно, что большое внимание должно уделяться со -хр анению нативной ультраструктур ы исследуемых объектов. Стало общепринятым мнение о том, что живая клетка не раствор, а, по удачному выр ажению Н .Г. Е сиповой, скорее аналог твер дого тела. Однако по-прежнему встречают -ся примеры, когда в конкретных биохимических исследованиях не учитывается сохранение на-тивных биофизических характеристик изучаемого объекта. Особенно стойко сохраняется это положение при использовании традиционных, давно принятых методов исследования. И х недостатки, даже очевидные, были пер екры-ты достижением новых успехов, а позже к ним привыкли и перестали обращать на них внимание. В настоящей работе мы проанализир уем такую ситуацию в очень интенсивно исследуемой области изучения дыхания митохондрий (МX) на выделенных препаратах. Благодаря выделению М X из клеток в середине пр ошлого века были достигнуты большие успехи в изучении протекающих в митохондриях химиче-

Сокращения: МХ - митохондрии, МРС - митохондри-ально-ретикулярная сеть, ФН - фосфат неорганический, И С - иммобилизационный стресс, ПСЭ - психоэмоциональный стресс, СДГ - сукцинатдегидрогеназа, КДГ -а-кетоглутаратдегидрогеназа, ЦБХ - цитобио химический.

ских процессов и используемых ими молеку-ляр ных механизмов. Однако позже становится очевидным, что на выделенных тр адиционным способом МX плохо выявляется физиологическая регуляция их функций в организме. П ри-чиной этого является разрушение «нежной» тотальной ультраструктуры, объединяющей МX в клетке в единую сеть с участием эндоплаз-матического ретикулума - митохондриально-ретикулярную сеть (МPC) (см. [1,2]). Тем не менее были достигнуты большие успехи в выяснении механизмов подвижности этой сети, осуществляющейся двумя противоположными процессами - распада и слияния МX [3-6]. Показано, что динамичность сети является о с-новным регулято ром физиологического состояния клеток. Очень интересны новые данные, выявившие защитное адаптационное значения процессов укрупнения М X, их слияния в ответ на умер енные стр ессовые воздействия в пределах физиологического диапазона. При усилении воздействий наблюдается необратимый р аспад МPC. Xочетcя напомнить, что в московском Институте биологической физики АН CCCP, послужившем родоначальником нашего Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН в Пущино, обратимые укрупнение и распад МX были обнаружены еще в 60-е годы А.Л. Шабадашом (см. [1]). На основании упомянутых исследований вопрос о важности сохранения МPC в опытах ех vivo для наблю-

дения ее pаботы in vivo пpедcтавляетcя веcьма актуальным [7]. Неcмотpя на это, измеpения дыxания по-пpежнему пpоводятся традиционным поляpогpафичеcким методом на выделен-нык МX, у котоpыx полноcтью pазpушена организация в М PC. Это обусловлено отcутcтвием дpугого cпоcоба и тем, что использовать для этой цели пер еживающие целые клетки нельзя, так как иx отстояние пp одолжает менятьcя вне оpганизма и не cоxpаняет инфоpмацию о cо-cтоянии, бывшем внутpи него. Поэтому используют пpивычное выделение М X и дыхание, как показатель иx отстояния. Микpо cкопичеcкие же иccледования пpи этом обычно не пpоводятcя и cтpуктуpные изменения не контpолиpуютcя. Оценка cо cтояния М X по дыханию обманчива: пpи более сильном pа cпаде анcамблей М X ско-pоcть дыxания возpаcтает. Обычно это воспри-нимаетcя как пpоявление иx xоpошей сохран-ноcти, однако может являтьcя пеpвым признаком потеpи cоcтояния покоя, как будет обcу-ждено ниже.

В данной pаботе мы xотим пpивлечь внимание к значительноcти pазp ушительного влияния на М X фактоpов, общепpинятыx в биохи-мичеcкиx иccледованияx, и обоcновать способ, позволяющий избежать этиx недоcтатков. Этот способ оcнован на cоxp анении тонкой нативной ультpаcтpуктуpной о pганизации М X в клетке. В cовpеменной физико-xимичеcкой биологии шиpоко pазpабатываютcя теxнологичеcкие пpиемы конcтpуиp ования наномаcштабныx ис-куccтвенныx уcтpойcтв, котоpые обеспечивают повышение эффективноcти иx pаботы. бедует также обpатить внимание на важность OTxp а -нения естественной биофизической ультра-cтpуктуpной оpганизации в отпоставимом масштабе. Вcе это позволит значительно повысить качеcтво исследований и пp иблизить иx к фи-зиологичеcким уcловиям.

НАPУШЕНИЯ БИОФИЗИЧЕ^ОЙ C ТРУКТУРЫ И ФУНКЦИЙ

МИТОXОНДPИЙ П PИ БИОXИМИЧЕCКИX И CCЛЕДОВАНИЯX

Для выделения из клеток МX в виде отдельные гранул пpежде вcего необxодимо раз-pушить нитчатую cтpуктуpу, cвязывающую иx в единую cеть. Pешение этой пр облемы успешно базируется на «трех китах» выделения М X -применении сахарозы, разведения и холода. Если регистрировать последствия выделения только по измерению дыхания, то остается незамеченным, что распад М PC пр иводит и к параллельной потер е возможности наблюдать вне ор га-

низма изменения, происходящие при функционирования МX в организме. Это становится очевидным при микроскопическом наблюдении за динамикой поведения фрагментов МPC -крупных и мелких ансамблей МX, которые удается сохранить в гомогенатах, полученных в измененных условиях по сравнению с традиционными [1,2]. Даже частичное приближение этих условий к условиям в клетке - замена сахарозы на хлористый калий, использование в 10 р аз меньшего разведения ткани в гомоге-нате и измерение пр и температуре 12-15°C -позволяет не только сохранить фрагменты сети, но и наблюдать вне организма как ее распад, так и спонтанную сборку [8,9]. Впервые вне организма выявляется этот по существу физиологический восстановительный процесс, сопровождающий работу МX в организме.

Выбор оптимальных условий основан на выявлении повреждающего воздействия обычно используемых в биохимических исследованиях факторов на сборку и разборку фрагментов сети. Их сопоставление с действием физиологических регуляторных факторов в организме показало, что распад фрагментов сети под воздействием используемых реактивов и условий аналогичен таковому же при действии возбуждающих и повреждающих воздействий в организме. Поэтому амплитуда изменений М X в организме, наблюдаемая ex vivo, сильно уменьшается или вовсе исчезает на органеллах, распавшихся на мелкие ансамбли и гранулы.

Далее представлены примеры действия исследованных факторов на обратимые ультраструктурные изменения биофизической организации МX в сопоставлении с их влиянием на дыхание.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Гомогенат печени крысы получали в среде, содержащей 125 мМ КCl, 10 мМ HEPES, рН 7,2 [10]. Контрольные и опытные пробы гомо-гената (1 мл) хр анили в тер мостатир уемы х ячейках при 2°C или 12°C. Для видеомикр оскопи-ческих измерений 30 мкл гомогената добавляли к 1 мл среды, перемешивали при стандартной скорости в течение 5 мин, помещали в камеру Нейбауэра и микроскопировали с применением техники темного поля.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Влияние сахарозы. Cpеда на основе са харо -зы (или близкого к ней маннита) незаменима при выделении изолир ованных М X и исследовании их биохимических функций. C помощью

Рис. 1. Разрушающее действие сахарозы на МРС. 30 мкл густого гомогената (1:1), приготовленного в среде KCl, перемешивали 5 мин в 970 мкл среды KCl (контроль) или в среде на основе сахарозы (0,25 М ) в течение 1, 2 или 5 мин. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего, n = 4, * - p < 0,05, ** -p < 0,001 относительно контроля. Над диаграммами приведены микроскопические изображения МРС (темное поле) в соответствующих условиях.

установки для морфометрического исследования ансамблей М X можно не только показать сам факт деструктивного действия сахарозы, но и количественно оценить этот процесс. Для этого были проведены эксперименты, в которых исходный гомогенат печени, приготовленный в среде КС1, помещали в ячейку с раствором сахарозы (0,25 М) и перемешивали в течение 1, 2 и 5 мин на магнитной мешалке.

На рис. 1 показано проявление разрушительного действия са хар озы на М РС: помещение препарата всего на 1 мин в среду, содержащую 0,25 М сахарозы, приводит к распаду ансамблей и уменьшению их средней площади на 30%, на 2 мин - более чем в 3,5 раза, а через 5 мин нахождения в среде с сахарозой ансамбли практически полностью распадаются на отдельные М X, а их средняя площадь уменьшается в 5 р аз!

Влияние концентрации гомогената на самосборку фрагментов сети. Ранее мы показали, что обычно используемое большое р азведение гомогената при выделении МX (1:10 и 1:8) приводит к распаду сети на отдельные гранулы. П ри этом полностью прекр ащается спонтанная самосборка сети [8-11].

Поэтому мы используем для исследования процессов самоорганизации МРС концентрированный по белку гомогенат в соотношении ткани и р а створ а К С1 1:1.

Рассыпание сети под воздействием холода.

Нами показано, что обычное проведение исследований на М X при темпер атуре 2-4°С оказывает сильное разрушающее действие на М РС [8-11]. Это обусловлено главным образом деполимеризацией тубулина при этой темп

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»