БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2015, том 32, № 3, с. 202-210
УДК 543.51
ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ПРОСТРАНСТВЕННОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ИОНОВ Pt+ В КЛЕТКАХ ГЛИОБЛАСТОМЫ, ОБРАБОТАННЫХ ЦИСПЛАТИНОМ, МЕТОДОМ ВРЕМЯПРОЛЕТНОЙ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ
ВТОРИЧНЫХ ИОНОВ
© 2015 г. А. А. Гулин1,2*, М. С. Павлюков3, С. К. Гуларян1, В. А. Надточенко1,24
Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, 199991, Москва, ул. Косыгина, 4;
*электронная почта: aleksandr.gulin@phystech.edu 2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет,
119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 3 3Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, РАН,
117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 4Институт проблем химической физики РАН, 142432, Московская обл., Ногинский район, г. Черноголовка, просп. Академика Семенова, 1 Поступила в редакцию 28.12.2014 г.
Методом времяпролетной масс-спектрометрии вторичных ионов выполнен анализ клеток глиобла-стомы человека (линия И87МО), обработанных фармакологическим препаратом цисплатин. Определено пространственное распределение ионов Р1+, №+, липидов в клетке. Показано, что концентрация ионов Р1+ внутри ядра клетки в 1.5 раза больше, чем в цитоплазме. В клетках, обработанной цисплатином обнаружено образование сфингозина, которое наблюдается в процессе апоптоза. В контрольных необработанных цисплатином клетках сфингозин не образуется.
Ключевые слова: масс-спектрометрия, ТОР-$1М$, визуализация, цисплатин, липидные мембраны, глиобластома.
Б01: 10.7868/80233475515030056
ВВЕДЕНИЕ
Метод времяпролетной масс-спектрометрии вторичных ионов (ТОБ-81М8) позволяет определять 3Э пространственное распределение химического соединения с разрешением около 100 нм в латеральном направлении и около 10 нм по глубине, при детектировании массы ионов до т/г ~ 1000. Такое пространственное разрешение недостижимо для других масс-спектрометрических методов (например, МЛЬЭ1-ТОР, ЭЕ81) [1]. Таким образом, метод предоставляет возможность визуализировать срезы тканей [2—4], единичные клетки и субклеточные органеллы [5—8] по химическому составу липидов и распределению важнейших ионов клеточной среды (№+, К+ , Са2+) при надлежащей пробоподготовке биологических образцов [9].
Настоящая работа решает две связанные между собой задачи: а) развития методов времяпролетной масс-спектрометрии вторичных ионов для исследования состава и структуры единичных клеток и тканей; б) изучения распределения внутри клеток глиобластомы человека (линия и87МО) химиче-
ского активатора апоптоза — молекулы фармакологического препарата цисплатина (цис-диамин-дихлорплатина II; [Р1(МИ3)2С12]).
Механизм действия цисплатина на сегодняшний день не до конца ясен, но хорошо известна зависимость эффективности этого препарата от дозы и экспозиции. Так, в высоких концентрациях (около 800 мкМ) он повреждает клеточные мембраны, при низких — 8 мкМ, в клетках регистрируется каскад процессов, характерных для апоптоза [10]. Все эти процессы разворачиваются преимущественно в ядре клетки и сопровождаются образованием связей между цисплатином и ДНК и конденсацией хроматина [11]. Таким образом, действие цисплатина в зависимости от его концентрации приводит к клеточной гибели либо через некроз, либо через апоптоз. В этой связи нам представлялось интересным проследить за распределением этого фармакологического препарата внутри клетки.
Ранее были изучены изменения элементного состава клеток под влиянием цисплатина. Было проанализировано влияние цисплатина на выход
ионов Na+, K+, Ca2+ в клетках почечного эпителия LLC-PKj с пространственным разрешением 60 мкм [12]. Изучение аналога цисплатина Tri-platinNC позволило установить пространственную локализацию ионов платины в клетках аде-нокарциномы молочной железы человека с пространственным разрешением 50 нм [13].
Следует отметить, что пространственное разрешение в TOF-SIMS масс-спектрометрии может варьировать в широких пределах: от десятков нм до сотен мкм [14]. Поскольку выход вторичных ионов пропорционален площади фокуса, и повышение пространственного разрешения приводит к сужению диапазона масс эффективно детектируемых ионов [14] и ухудшению чувствительности, анализ органических соединений при максимально высоком пространственном разрешении оказывается затруднительным, ввиду крайне низкого выхода таких ионов.
В нашей работе найден компромисс между пространственным разрешением и интенсивностью сигнала основных липидных компонентов биомембран клетки. Используемое пространственное разрешение (500 нм) позволило достаточно точно определить локализацию цисплати-на в клетке и одновременно с этим провести анализ липидного состава клеточных мембран.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Культивирование клеток. Клетки линии U87MG культивировали в С02-инкубаторе при температуре +37°С в атмосфере с 5% содержанием С02 и 100% влажностью. В качестве культу-ральной среды использовали среду ДМЕМ (Sigma) с добавлением 10% плодной сыворотки крупного рогатого скота (HyClone). За 1 сут перед экспериментом клетки пересаживали в лунки 24-луночного планшета, на дно которых были помещены предварительно простерилизованные кремниевые пластины (J&J. Co). На следующий день в культураль-ную среду добавляли цисплатин (Teva, концентрация 30 мкМ), после чего клетки инкубировали в СО2-инкубаторе в течение 48 ч. После инкубации клетки трижды промывали фосфатным буфером стандартного состава (PBS) и фиксировали 4% раствором формальдегида в PBS при комнатной температуре в течение 15 мин. После фиксации клетки еще трижды промывали фосфатным буфером и водой mQ с последующей дегидратацией препарата в вакууме с давлением ~500 мкПа (5 х х 10-6 мбар) в течение 5 ч.
TOF-SIMS анализ. Высушенные образцы (фиксированные клетки на кремниевых подложках) исследовали при помощи времяпролетного масс-спектрометра вторичных ионов TOF-SIMS 5 (ION-TOF, Германия). В качестве источника ионизации образца использовали импульсы сфо-
кусированного пучка кластерных ионов Bi+ с энергией 30 кэВ. Интенсивность пучка первичных ионов контролировали по их току на специальном датчике — цилиндре Фарадея.
Во всех экспериментах для компенсации статического заряда, накапливающегося на поверхности образца при бомбардировке положительно заряженными первичными ионами, использовали электронную пушку. Энергия электронов не превышала 25 эВ. Для повышения эффективности детектирования вторичные ионы разгоняли в электромагнитном поле до 10 кэВ.
Для "травления" поверхности образца использовали цезиевую пушку с энергией ионов около 2 кэВ, работающую в непрерывном режиме. Длительность обработки поверхности образца ионами Cs+ - 400 с.
Масс-спектрометрию образцов проводили в двух режимах: спектроскопическом и режиме картирования (imaging). В спектроскопическом режиме диаметр фокусировки пучка первичных ионов составлял 5 мкм. Длительность импульса не превышала 20 нс. Измерения проводили с участка размером 500 х 500 мкм с разрешением 128 х 128 пикселей. Плотность дозы облучения первичных ионов (primary ion dose density, PIDD) ~2.5 х 1011 ионов/см2.
В режиме картирования (имиджинга) пучок первичных ионов был сфокусирован до диаметра 500 нм, длительность импульса составляла 50-60 нс. Измерения проводили либо с области 150 х 150 мкм с разрешением 256 х 256 пикселей, либо с области 250 х 250 мкм с разрешением 512 х 512 пикселей. Плотность дозы облучения первичных ионов в различных экспериментах находилась в интервале от 3.5 х 1012 до 4.7 х 1012 ионов/см2.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Послойное картирование клетки. Визуализацию распределения цисплатина внутри клетки осуществляли с помощью стандартной процедуры, входящей в набор методик TOF-SIMS-анали-за: "травления" поверхности исследуемого объекта при бомбардировке заряженными ионами. Для травления поверхности использовали как специальную ионную пушку, бомбардирующую поверхность ионами Cs+, так и травление ионами Bi+ "основной" пушки, работающей в непрерывном режиме. Процедура травления позволяет послойно исследовать состав клетки.
Поскольку спектр записывается независимо с каждого пикселя, можно визуализировать распределение того или иного иона внутри клетки. Данная методика называется масс-спектрометри-ческим "имиджингом", т.е. построением изображения объекта по пространственному распределению
42
16
10
л. ./7
■
*
ч. 20 мкм
в f п-п
88
42
4
Рис. 1. Масс-спектрометрическое картирование клеток глиобластомы человека (U87MG) после бомбардировки ионами Cs+ (область 150 х 150 мкм, разрешение изображения 256 х 256 пикселей). а — Все положительно заряженные ионы; б — ионы натрия, m/z = 22.98; в — ионы фрагмента "головной" группы молекулы фосфатидилхолина, m/z = 184.07. Четко определяется негативное изображение двух ядер, указанных стрелочками.
вторичных ионов. На рис. 1 представлены результаты распределения всех зарегистрированных вторичных ионов (рис. 1а), ионов натрия m/z = 22.98 (рис. 1б) и иона головной группы молекул фосфатидилхолина и сфингомиелина m/z = 184.07 (рис. 1в). Ионные изображения соответствуют одной области на поверхности образца. Для наглядности на рис. 1 стрелками обозначены области, соответствующие ядрам двух клеток.
Результаты данного эксперимента наглядно показывают, что после травления клеток происходит "испарение" наружной части плазматической мембраны клетки, а также верхней — апекс-ной части ядерной мембраны. Этот вывод подтверждается неоднородным распределением ионов натрия и фосфохолина — головной группы молекул фосфатидилхолина и сфингомиелина. Пространственное распределение фрагментарного иона фосфолипидов (рис. 1в) маркирует границы цитоплазмы, а богатые фосфолипидом внутриклеточные органеллы контрастируют форму клеточного ядра.
Таким образом удалось показать, что процедура травления образца клеток, фиксированных на поверхности кремниевой пластины, позволяет избирательно удалить участки плазматической и ядерной мембран и оценить внутренний молекулярный состав цитоплазмы и ядра.
Внутриклеточное распределение цисплатина в клетках линии U87MG в экспериментальной модели активации апоптоза. Распределение ионов
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.