ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2007, том 414, № 2, с. 273-276
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 576:539.1.04
ВКЛАД ИНДУЦИБЕЛЬНЫХ И КОНСТИТУТИВНЫХ МЕХАНИЗМОВ В ПРИОБРЕТЕНИЕ РАДИОРЕЗИСТЕНТНОСТИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМИ ФИБРОБЛАСТАМИ ХОМЯЧКА
© 2007 г. Е. Г. Тырсина, С. В. Сланина, Е. Д. Алипов
Представлено академиком Г.И. Абелевым 14.11.2006 г. Поступило 24.11.2006 г.
Преодоление индуцированной у-облучением радиорезистентности (РР) опухолей остается одной из кардинальных проблем радиационной онкологии [1]. Для ее успешного решения необходимо выяснение фундаментальных механизмов, природы и путей формирования РР.
Ранее для изучения приобретенной РР мы смоделировали данное явление in vitro и получили клеточную систему, состоящую из родственных линий злокачественных клеток, резко различающихся по радиочувствительности: родительской линии ДХ-ТК- и потомков этих клеток, переживших у-облучение в дозе 20 Гр, линии ПОК-20 [2]. Втрое возросшая (по критерию D0) РР клеток-потомков была подтверждена в полужидкой среде, а также в условиях in vivo [2, 3]. Далее предстояло выяснить причины возникновения чрезвычайно высокой устойчивости клеток ПОК-20 к радиации. Из литературы известно, что в основе развития РР могут лежать как индуцибельные, так и конститутивные процессы. К первым относят активацию транскрипционных факторов и их влияние на гены, экспрессия которых модифицирует радиочувствительность через процессы контроля клеточного цикла [4], апоптоза [5] или ДНК-репарации [6]. С другой стороны, имеются данные о том, что радиочувствительность не коррелирует ни с уровнем апоптоза и экспрессией контролирующих его генов [7], ни с исходным количеством двунитевых разрывов ДНК или кинетикой репарации [8, 9], а целиком определяется особенностями структурной организации хроматина [3, 8, 9], т.е. конститутивными механизмами.
Научно-исследовательский институт канцерогенеза Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина
Российской Академии медицинских наук, Москва Государственное унитарное предприятие г. Москвы Эколого-технологический и научно-исследовательский центр по обезвреживанию РАО и охране окружающей среды "Радон", Москва
К настоящему времени результаты исследований по поиску определяющей детерминанты РР разрознены и противоречивы. Это можно объяснить как спецификой конкретной клеточной линии, так и тем обстоятельством, что РР обусловлена не одним, а несколькими факторами. К тому же в большинстве исследований сравнительное изучение радиочувствительных и радиорезистентных линий проведено на клетках различного гистогенеза, что снижает объективность полученных данных. С учетом изложенного выше целью настоящей работы явилось изучение роли некоторых индуцибельных и конститутивных процессов в формировании приобретенной РР на клеточной модели, состоящей из изогенных линий с разной радиочувствительностью. Среди индуцибельных были исследованы такие факторы, как уровень радиоиндуцированного апоптоза (по качественным и количественным критериям), функциональная активность гена ТР53 и клеточный цикл. Роль конститутивных процессов оценивали по показателям плоидности и структурной организации хроматина клеток.
Все исследования in vitro проводили на трансформированных фибробластах джунгарского хомячка: радиочувствительной родительской линии ДХ-ТК- и радиорезистентной линии потомков облученных клеток - ПОК-20. Характеристика линий, условия культивирования и у-облучения, а также метод ДНК-фингерпринтинга с использованием мини- и микросателлитных ДНК описаны в [2]. Распределение клеток по фазам цикла изучали через 6, 8, 12 и 18 ч после облучения в дозе 12.5 Гр с использованием цитофлуориметра "Coulter Epics-C". Для выявления характерной для апоптоза фрагментации ДНК клетки облучали в дозах 12.5, 15 и 20 Гр, инкубировали при 37°С в течение 20, 30 и 40 ч и проводили электрофорез ДНК в 2%-ном агарозном геле на приборе "BioRad". Морфологическое выявление апоптотиче-ских клеток проводили через 24, 48 и 72 ч после радиационного воздействия в дозе 10 Гр. Клетки окрашивали красителем Hoechst 33258 (2 мкг/мл)
Рис. 1. ДНК-фингерпринтинг клеток линии ДХ-ТК- (1); радиорезистентной линии ПОК-20 - потомков клеток ДХ-ТК-, выживших после облучения в дозе 20 Гр, 20-й пассаж (2) и 80-й пассаж (3). Для гибридизации использованы пробы: а - (TTAGGG)4, б - ДНК фага M13, в - (TCC)50.
и исследовали под флуоресцентным микроскопом "Opton", просчитывая по 5000 клеток на группу. Функциональную активность гена ТР53 оценивали САТ-методом в соответствии с протоколом [10]. Клетки трансфецировали плазмидой, экспрессирующей хлорамфениколацетилтранс-феразу (САТ) под контролем промотора, содержащего ТР53-респонсивный элемент САТ-Waf. Через 24 ч после трансфекции клетки облучали в дозе 12.5 Гр, а спустя 48 ч определяли уровень САТ-активности. Анализ числа хромосом проводили на окрашенных красителем Гимза препаратах по 50 метафазным пластинкам. Структурную организацию хроматина исследовали с помощью метода аномальных временных зависимостей вязкости (АВЗВ) с использованием ротационного вискозиметра. По показателям вязкости хроматина (лизатов) клеток изучали: 1) исходную (без облучения) компактизацию хроматина; 2) до-зовую (0-15 Гр) зависимость релаксации хроматина; 3) степень восстановления его структуры через 2 ч после облучения в дозах 5, 10 и 15 Гр. Методы изучения хроматина приведены в работе [3]. Статистическую обработку данных проводили с использованием критерия Стьюдента сp < 0.05.
Поскольку выделенные потомки облученных клеток линии П0К-20 по многим свойствам сильно отличались от родительских ДХ-ТК- [2], необходимо было убедиться в их родстве, которое было подтверждено методом ДНК-фингерпринтинга.
Рис. 2. Доля клеток линий ДХ-ТК- и ПОК-20 в Б-фазе
клеточного цикла в первые часы после облучения в
дозе 12.5 Гр.
На рис. 1 видно, что гибридизация с минисател-литной пробой М13 и микросателлитными пробами (ТСС)50 и (ТТAGGG)4 дала хорошо различимые полосы в диапазонах 2-9.4, 3.5-23.1 и 3.0-6.0 т.п.н. соответственно. Сравнительный анализ этих участков показал полную идентичность образца линии ДХ-ТК- и двух образцов линии ПОК-20: 20-го и 80-го пассажей. Таким образом доказано, что клетки П0К-20 являются истинными потомками родительских клеток ДХ-ТК-.
Распределение по фазам митотического цикла интактных клеток обеих линий достоверно не различалось. Доля клеток в G0/G1-, Б- и G2/M-фа-зах линии ДХ-ТК- составила 51.3 ± 1.6, 24.9 ± 1.4 и 23.9 ± 1.3 % , а линии П0К-20 56.3 ± 1.6, 23.3 ± 1.3 и 20.4 ± 1.3 %. Отличие между радиочувствительными и резистентными клетками выявлено только после облучения в дозе 12.5 Гр, когда через 6 ч после воздействия в культуре ДХ-ТК-был зарегистрирован кратковременный Б-блок (45% клеток), в то время как радиорезистентные клетки П0К-20 продвигались по циклу без такой задержки (рис. 2).
Электрофорез ДНК исходных клеток ДХ-ТК- и радиорезистентных П0К-20 при всех исследованных дозовых и временных диапазонах не выявил характерной "лестницы" нуклеосомного расщепления ДНК, являющейся качественным признаком апоптоза. При подсчете апоптотических клеток по морфологическим критериям обнаружено, что этому типу гибели в норме подвергалось лишь 1-2% клеток обеих линий, а после радиационного воздей-
ВКЛАД ИНДУЦИБЕЛЬНЫХ И КОНСТИТУТИВНЫХ МЕХАНИЗМОВ
275
ствия в дозе 10 Гр - не выше 10%, хотя согласно кривым выживаемости [2] при дозе 10 Гр погибало 95% клеток ДХ-ТК- и 75% клеток П0К-20. Это свидетельствует о том, что для исследуемых линий вклад апоптотической гибели в общий летальный эффект ничтожен.
Известно, что подавление функциональной активности гена ТР53 часто приводит к повышению клеточной РР [11]. Однако сравнительный анализ данных САТ-теста показал, что клетки ДХ-ТК- и П0К-20 идентичны по статусу ТР53. В них также не происходила активация белка ТР53 как транскрипционного фактора в ответ на у-облучение в дозе 12.5 Гр. Следовательно, высокая РР клеток П0К-20 не связана с изменением функциональной активности ТР53.
Таким образом, ни один из исследованных ин-дуцибельных механизмов не вовлечен в процесс приобретения клетками П0К-20 высокой РР.
Данные литературы о связи радиоустойчивости клеток с количеством в них ДНК неоднозначны. Так, если в работе [12] показано, что радиорезистентные опухолевые клетки были полиплоидными и содержали вдвое больше ДНК по сравнению с радиочувствительными, то в исследовании [13] корреляции между плоидностью и уровнем радиочувствительности не обнаружено. Мы также показали, что радиорезистентная и радиочувствительная линии почти не различались по числу хромосом (80% клеток П0К-20 и 64% клеток ДХ-ТК- содержали по 26 хромосом), являясь гиподи-плоидными.
В последнее время все большее число исследователей предлагают в качестве интегральной детерминанты клеточной радиочувствительности рассматривать такую базовую клеточную характеристику, как конформация интерфазного хроматина, поскольку она оказывает влияние на все основные внутриклеточные процессы. В ходе изучения структурной организации хроматина по критериям его вязкостных свойств обнаружено, что в интактных радиорезистентных клетках П0К-20 хроматин оказался ~ в 1.4 раза плотнее упакован, чем в радиочувствительных ДХ-ТК-[3]. Большая плотность хроматина резистентных потомков может свидетельствовать об уменьшении размера у них или самих петель ДНК за счет появления новых сайтов "заякоревания" на ядерных структурах, или суперспиральных доменов петель за счет рекрутирования белков на хроматин. Первое предположение основано на результатах работ непосредственного измерения длины петель хроматина с помощью хало- или кометно-го анализа [8, 14]. В работе [8] обнаружено, что средний размер длины петель в радиочувствительных клетках НХ142 был в 1.25 раза больше, чем в радиорезистентных RT112. В качестве одной из причин повышенной компактности хрома-
тина клеток П0К-20 можно рассматривать изменение спектра ДНК-связанных белков, которые, как показано в работах [8, 15], контролируют уровень "остаточных" (неотрепарированных или ошибочно репарированных) повреждений ДНК. Мы предпол
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.