научная статья по теме ВКЛЮЧЕНИЕ 2-14C-АЦЕТАТА В ЛИПИДЫ ИЗОЛИРОВАННЫХ ЯДЕР И ЦИТОЗОЛЬНОЙ ФРАКЦИИ КЛЕТОК ТИМУСА КРЫС Биология

Текст научной статьи на тему «ВКЛЮЧЕНИЕ 2-14C-АЦЕТАТА В ЛИПИДЫ ИЗОЛИРОВАННЫХ ЯДЕР И ЦИТОЗОЛЬНОЙ ФРАКЦИИ КЛЕТОК ТИМУСА КРЫС»

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 1, с. 50-57

УДК 577.125

ВКЛЮЧЕНИЕ 2-14С-АЦЕТАТА В ЛИПИДЫ ИЗОЛИРОВАННЫХ ЯДЕР И ЦИТОЗОЛЬНОЙ ФРАКЦИИ КЛЕТОК ТИМУСА КРЫС

© 2008 г. Т. П. Кулагина

Институт биофизики клетки РАН, 142290 Пущино Московской обл.; факс: (7-4967)33-05-09, электронная почта: kulagina@icb.psn.ru

Поступила в редакцию 19.06.2007 г. После доработки 24.08.2007 г.

Известно, что ядрам клеток млекопитающих присущ активный липидный метаболизм, причем внутриядерные системы с участием липидных мессенджеров могут функционировать независимо от мембранных и цитозольных сигнальных механизмов. Представление об этой автономности сформулировано на основании обнаружения синтеза полифосфоинозитидов и фосфатидилхолина, а также ферментов их синтеза в ядрах клеток млекопитающих. Использование 2-14С-ацетата, включающегося в фосфолипиды в составе жирнокислотных цепей, предоставляет дополнительные возможности для выяснения путей синтеза внутриядерных липидов. В данной работе проведено сравнительное исследование включения радиоактивного предшественника в липиды цитозоля и изолированных ядер при их раздельной и совместной инкубации. Показано, что максимальное включение 2-14С-ацетата в липиды наблюдается при инкубации одного цитозоля. Изолированные ядра также способны включать радиоактивный ацетат в липиды. Однако радиоактивность липидов изолированных ядер значительно ниже, чем липидов цитозоля. При совместной инкубации изолированных ядер и цитозоля наблюдается ингибирование включения вновь синтезированных жирных кислот в фосфолипиды ядер. Вследствие этого в ядрах происходит накопление радиоактивных свободных жирных кислот. В цитозоле вновь синтезированные радиоактивные жирные кислоты активно включаются в фосфолипиды, не накапливаясь в свободном виде. Количество свободных жирных кислот при инкубации ядер с цитозо-лем снижается в обеих фракциях, тогда как количество фосфолипидов и холестерина остается неизменным. Обсуждаются возможные механизмы появления радиоактивных липидов в изолированных ядрах клеток тимуса крыс.

Результаты исследований метаболизма липидов в ядрах клеток млекопитающих способствовали формированию представления о его значительной автономности [1-5]. Метаболизм ядерных липидов играет важную роль в регуляции процессов, протекающих как в самом ядре, так и в целой клетке. При этом состав жирнокислотных цепей фосфолипидов (ФЛ) взаимосвязан с функциональным состоянием клетки [6-8]. Ранее в ряде работ с использованием предшественника синтеза липидов 2-14С-ацетата нами была показана более высокая радиоактивность липидов хроматина по сравнению с липидами целых ядер [9]. Это свидетельствует о направленном транспорте вновь синтезированных липидов из места их синтеза - эндоплаз-матического ретикулума - в хроматин без усреднения их радиоактивности с липидами ядерной мембраны. Однако нельзя исключить возможность синтеза липидов и в самих ядрах. В предыдущей работе показано, что высокоочищенные ядра клеток тимуса способны включать радиоактивный ацетат в липиды [10]. Радиоактивность ФЛ в этом случае обусловлена радиоактивностью их

жирнокислотных цепей. Однако по классическим представлениям синтез жирных кислот (ЖК) происходит в растворимом синтетическом комплексе, локализованном в цитоплазме. Сведения о наличии в ядрах клеток млекопитающих ферментов синтеза ЖК ограничены. Так, в ядрах клеток печени крыс обнаружены ацилСоА-синтаза и Д5-деса-тураза ЖК [ 11 ]; ацил-СоА-синтазная активность найдена в ядрах нейронов коры головного мозга кроликов [12]. Данные о возможности синтеза ЖК в изолированных ядрах клеток млекопитающих из низкомолекулярных предшественников отсутствуют.

Ядра клеток тимуса являются удобной моделью для исследования возможности синтеза липидов с использованием 2-14С-ацетата. В них обнаружен цикл трикарбоновых кислот, гликолиз, электрон-транспортная цепь, показан синтез АТР, количество которого сравнимо с количеством АТР в целой клетке. Они способны синтезировать из ацетата ацетил-СоА - основной структурный компонент синтеза ЖК и холестерина [13]. Задача данной работы - сравнительное исследование включения

2-14С-ацетата в липиды цитозольной фракции и изолированных ядер клеток тимуса при их раздельной и совместной инкубации с целью выяснения особенностей липидного метаболизма в этих структурах.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Ядра и цитозольную фракцию выделяли из ткани тимуса крыс-самцов линии Вистар массой 180— 200 г. Все операции по выделению ядер и получению цитозольной фракции проводили при 0-4°С. Ядра выделяли в градиенте плотности 2.2 М сахарозы ("Merck", Германия), приготовленной на 0.01 М трис-буфере ("Sigma", США), содержащем 3 мМ MgCl2 ("Sigma" США), pH 7.4. Чистоту выделенных ядерных препаратов контролировали методом электронной микроскопии, а также по наличию в ядрах примесей маркерных ферментов плазматической мембраны, эндоплазматического ретику-лума и митохондрий - 5'-нуклеотидазы, глюкозо-6-фосфатазы и сукцинатдегидрогеназы, как описано ранее [10]. Ядра инкубировали в 0.01 М трис-буфере, содержащем 0.25 М сахарозу и 3 мМ MgCl2, рН 7.4 при 37°С (далее - "буфер"). Для получения цитозольной фракции ткань тимуса гомогенизировали в 10 объемах (вес/объем) этого буфера. Гомогенат фильтровали, осаждали ядра (при 700 g), а затем митохондриальную фракцию (при 15000 g). Супернатант после осаждения митохондрий центрифугировали при 200000 g в течение 2 ч, осадок отбрасывали, супернатант использовали как цитозольную фракцию. Цитозоль и ядра выделяли так, чтобы к началу инкубации получить обе фракции одновременно. Фракцию ядер делили на две части, одну часть инкубировали в буфере, другую - в цитозоле. Содержание белка в ядерной фракции - 5.21 ± 0.30 мг/мл инкубационной смеси, белка в цитозольной фракции - 2.1 ± 0.21 мг/мл ци-тозоля. Количество ядер в каждом эксперименте в пересчете на количество белка составляло не менее 25 мг, цитозоля - не менее 10 мг. Во все исследуемые фракции добавляли предшественник синтеза липидов 2-14С-ацетат ("Изотоп", Россия) с удельной радиоактивностью 1.8 ГБк/ммоль в концентрации 0.4 МБк/мл и инкубировали их при 37°С в течение 10 мин. Время инкубации было определено в предварительных экспериментах по динамике включения радиоактивной метки в суммарную кислотонерастворимую фракцию белков и липидов изолированных ядер, а также по динамике включения метки в липиды изолированных ядер [10]. Включение 2-14С-ацетата достигало максимума через 5 мин инкубации ядер и сохранялось на этом уровне в течение 30 мин. По окончании инкубации суспензию ядер быстро охлаждали во льду и осаждали ядра центрифугированием. Фракции ядер, цитозоля без инкубации, инкубированного цитозоля и цитозоля, полученного после совместной инкубации с ядрами, использовали для

анализа липидов. Липиды разделяли методом одномерной тонкослойной хроматографии. Нейтральные липиды разделяли в системе гексан : диэтило-вый эфир : ледяная уксусная кислота (73 : 25 : 2 по объему), фосфолипиды - в системе метилацетат : я-пропанол : хлороформ : метанол : 0.25%-ный KCl (25 : 25 : 25 : 10 : 9 по объему). Липидный фосфор определяли по методу Герлаха-Дойтике [14], холестерин и ЖК - по методу Марша [15]. Радиоактивность образцов считали на сцинтилляционном счетчике. Белок определяли по методу Лоури.

Степень межнуклеосомной фрагментации ДНК в процессе инкубации ядер оценивали с помощью электрофореза в 1.8%-ном агарозном геле, как описано ранее [16]. Результаты опытов подвергали вариационно-статистической обработке с использованием критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Электронная микроскопия и определение активности маркерных ферментов плазматической мембраны, эндоплазматического ретикулума и митохондрий показали высокую степень очистки ядер. В препаратах ядер активность 5'-нуклеотида-зы составляла 4.7%, активность глюкозо-6-фосфа-тазы - 1.1%, сукцинатдегидрогеназы - 47% от активности этих ферментов в гомогенате. Высокая активность сукцинатдегидрогеназы обусловлена наличием этого фермента в ядрах клеток тимуса [13].

Результаты электрофореза ДНК свидетельствуют о том, что при инкубации ядер в цитозоле в них происходит резкое увеличение степени межнуклеосомной фрагментации хроматина по сравнению с ядрами, инкубированными в буфере (рис. 1).

Во всех исследованных фракциях определяли радиоактивность суммарных липидов, суммарных ФЛ, а также количество и удельную радиоактивность свободных ЖК, индивидуальных ФЛ и холестерина.

Количество липидов во всех вариантах опытов представлено в табл. 1. При инкубации ядер с ци-тозолем количество ФЛ и холестерина в них не изменяется, а количество свободных ЖК снижено по сравнению с ядрами, инкубированными в буфере. В цитозоле после его инкубации с ядрами количество ФЛ и холестерина также не изменялось, а количество свободных ЖК было меньше, чем до инкубации. При инкубации одного цитозоля количество свободных ЖК также незначительно снижалось.

Радиоактивность суммарных липидов и суммарных ФЛ представлена в табл. 2. Полученные результаты свидетельствуют, что радиоактивный предшественник наиболее интенсивно включается в липиды при инкубации одного цитозоля. Радиоактивность (в пересчете на количество белка в 1 мл суспензии ядер или цитозоля) суммарных липидов ядер (~7400 имп/мин), инкубированных в бу-

1

3

Электрофореграмма ДНК ядер из клеток тимуса крыс в 1.8% агарозном геле. 1 - ДНК ядер, не подвергавшихся инкубации. 2 - ДНК ядер, инкубированных в буфере в течение 10 мин. 3 - ДНК ядер, инкубированных в ци-тозоле в течение 10 мин.

фере, превышает радиоактивность суммарных липидов как ядер (~3855 имп/мин), так и цитозоля (~3550 имп/мин) при их совместной инкубации. Более низкая радиоактивность суммарных липидов ядер и цитозоля при совместной инкубации свидетельствует о снижении синтеза липидов. Сниже-

ние синтеза не связано с недостатком меченого ацетата, исходная концентрация которого одинакова во всех вариантах эксперимента. Это подтверждает более высокая радиоактивность суммарных липидов цитозоля (~13800 имп/мин), инкубированного в отсутствие ядер.

Удельная радиоактивность липидов представлена в табл.

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком