ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 4, с. 466-471
УДК 577.21
ВЛИЯНИЕ 5-АЗАЦИТИДИИА ИА СВЕТОЧУВСТВИТЕЛЬНОЕ ОБРАЗОВАНИЕ ПОЛОВЫХ И БЕСПОЛЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ СТРУКТУР У МУТАНТОВ wc-1 И wc-2 Neurospora crassa
© 2004 г. С. Ю. Филиппович, Г. П. Бачурина, М. С. Крицкий
Институт биохимии им. АН. Баха РАН, Москва 119071; e-mail: syf@inbi.ras.ru Поступила в редакцию 24.10.2003 г.
В условиях голода по азоту освещение синим светом wc-1 и wc-2 мутантов аскомицета Neurospora crassa не приводило к стимуляции образования протоперитециев и ингибированию формирования конидий, наблюдавшихся на мицелии дикого типа гриба. Полученные данные свидетельствуют об участии генов wc-1 и wc-2 в светозависимом образовании протоперитециев и конидий N. crassa. Учитывая действие ингибитора метилирования ДНК, 5-азацитидина, на процессы развития в этих же условиях, предполагается, что баланс между образованием половых и бесполых репродуктивных структур, поддерживаемый в организме N. crassa, зависит от процессов метилирования генома, чувствительных к действию света, опосредованному фоторецепторным комплексом WC-белков.
Знание механизмов индивидуального развития, в том числе спорообразования, чрезвычайно важно для возможности регуляции биосинтетических процессов у мицелиальных грибов. Среди различных внешних факторов особое место в регуляции развития этих организмов занимает свет [1, 2]. Аскомицет Neurospora crassa представляет собой уникальный лабораторный микроорганизм для исследования биохимических основ фотоморфогенеза грибов. Синий свет является мощным регулятором многих физиологических процессов у этого организма. Среди них - ингибирование и сдвиг светом циркадных ритмов конидиогенеза [3], фотостимуляция образования протоперитециев [4]; положительный фототропизм перитециев [5] и изменение их полярности [6], а также индукция биосинтеза каротиноидных пигментов в вегетативном мицелии гриба [7]. Кроме того, установлена связь между фотопроцессами, влияющими на морфогенез этого организма, и электро-генезом его клеточных мембран [8-10].
Помимо наличия четко различимых морфологически фаз развития, а также относительной простоты культивирования, преимущество N. crassa как объекта для изучения процессов дифферен-цировки состоит в том, что этот мицелиальный гриб детально охарактеризован с генетической точки зрения - у него получено множество разнообразных мутантов [11] и расшифрован геном [12]. Установлено, что гены white collar-1 (wc-1) и white collar-2 (wc-2) необходимы для ответа N. crassa на действие синего света [11, 13]. Мутанты wc-1 и wc-2 являются "слепыми" по многим фенотипи-ческим признакам - даже после освещения они обладают белым мицелием, поскольку не способ-
ны образовывать в нем каротиноиды вследствие нарушения механизма фотоиндукции этих пигментов, хотя нормально синтезируют их в конидиях. Показано, что белки WC-1 и WC-2, кодируемые указанными выше генами, формируют фо-торецепторный комплекс, который участвует в преобразовании сигнала синего света [14, 15].
В последнее время N. ота88а стали использовать как модель для исследования особенностей метилирования ДНК, т.е. энзиматического присоединения метильных групп к цитозиновым остаткам ДНК [16]. Ввиду того, что мутации по метилированию ДНК часто летальны или приводят к резким аномалиям в дифференцировке у млекопитающих и растений, чрезвычайно ценной оказалась возможность изучения этого процесса у данного гриба, для которого были получены соответствующие жизнеспособные мутанты.
Развитие N. ота88а может происходить двумя основными способами - по половому или бесполому циклам, причем оба эти пути в определенных условиях являются фоторегулирумыми. В условиях голода по углероду на поверхностно растущем мицелии образуются оранжево-красные вегетативные споры, конидии, и синий свет стимулирует их формирование [17]. При развитии гриба на среде, дефицитной по азоту, синий свет индуцирует образование половых структур -предшественников женских плодовых тел, протоперитециев [4, 18], которые в ходе дальнейшего развития превращаются в перитеции и после слияния с клетками противоположного типа спаривания и мейоза образуют черные половые споры - аскоспоры. Вместе с тем в этих условиях на мицелии позднее, помимо протоперитециев, образу-
ются и конидии, но в гораздо меньшем количестве, чем в условиях голода по углероду. Нами установлено, что в условиях голода по азоту кратковременное освещение мицелия N. crassa синим светом сильно ингибирует образование конидий [19]. Очевидно, при реализации онтогенетической программы N. crassa поддерживается баланс между образованием половых и бесполых репродуктивных структур. В темноте он сдвинут в сторону образования бесполых спор, конидий, а обработка синим светом приводит к сдвигу в сторону образования половых структур, протоперитециев. Было установлено также, что добавление к клеткам гриба в условиях голода по азоту 5-азацитидина - ингибитора метилирования ДНК, вызывало действие противоположное влиянию света, т.е. подавляло образование протоперитециев и стимулировало кони-диогенез, что указывало на участие фоторегули-руемого метилирования ДНК в выборе полового или бесполого пути развития N. crassa.
В данной статье исследовано влияние света и 5-азацитидина на образование протоперитециев и конидий у мутантов wc-1- и wc-2 N. crassa в условиях голодания по азоту.
Цель работы - установить, находится ли кони-диогенез, как и образование протоперитециев, под контролем фоторецепторного комплекса WC-1/WC-2 и сказывается ли действие ингибитора метилирования ДНК на выбор организмом полового или бесполого пути развития в условиях генетически блокированной фоторецепторной системы.
МЕТОДИКА
Биологическим материалом служили следующие штаммы N. crassa, любезно предоставленные американским Центром по хранению генетического материала грибов (Fungal Genetic Stock Center, Kanzas City) - дикий тип wt FGSC 987 (аллель 74-OR23-1A), а также мутанты wc-1 FGSC 4397 (аллель ER53) и wc-2 FGSC 3817 (аллель 234w).
Для инокуляции использовали суспензию конидий N. crassa, хранившуюся при -70°C. Ее получали путем смыва спор дистиллированной водой с поверхности шестидневной культуры гриба, выращенной на 2%-ной агаризованной среде Фогеля [20]. Конидии отделяли от мицелия путем фильтрования через марлю и стеклянную вату. Концентрация суспензии хранящихся спор составляла 10 мг/мл.
Для получения протоперитециев 1 х 105 конидий соответствующего штамма N. crassa равномерно распределяли шпателем по поверхности целлофана диаметром 8 см, помещенного на ага-ризованную модифицированную по азоту и углероду среду Фогеля. В ней вместо нитрата аммония использовали 4 мМ NH4Cl, а вместо сахарозы -смесь 1%-ной сорбозы (w/v) и 0.1%-ной глюкозы (w/v). Эту смесь стерилизовали отдельно паром в
виде 20-кратно концентрированного раствора дважды (через 2 сут) и добавляли к расплавленной среде роста. Рост культуры осуществляли при 23°C в темноте в течение 3 сут. Затем в темноте в стерильных условиях переносили целлофановые диски с мицелием N. crassa на чашки Петри со свежей модифицированной средой Фогеля, но без NH4Cl (голод по азоту) и вновь инкубировали в темноте при 23°C. На 4 сут после инокуляции конидий для стимуляции образования протоперитециев культуры в течение 2 мин освещали синим светом в диапазоне от 370 до 500 нм (в качестве светофильтров использовали цветные стекла СС5, С3-С22 и 1%-ный водный раствор CuSO4). Интенсивность освещения составляла 1 Вт м-2. Контролем служила темновая культура. Подсчет образовавшихся протоперитециев (в расчете на 1 см2 поверхности) производили при красном свете под бинокулярным микроскопом после 2-сут темновой инкубации мицелия при 23°C. Для этого чашку Петри разделяли на 10 секторов и подсчитывали число протоперитециев в каждом секторе, а затем из полученных данных вычисляли среднее значение.
Для оценки интенсивности бесполого спороге-неза через 4 сут темновой инкубации при 23°C собирали конидии, добавив 5 мл дистиллированной воды на чашку Петри, и проводили рассев серии их разведений (плейтинг) на модифицированную среду Фогеля с NH4Cl, сорбозой и глюкозой. После двухдневной инкубации в тех же условиях по числу образовавшихся колоний подсчитывали число жизнеспособных конидий (в расчете на 1 см2 поверхности).
Ингибиторный анализ проводили, добавляя предварительно профильтрованный через стерильный мембранный фильтр с размером пор 0.2 микрона фирмы "Corning" (США) раствор 5-азацитидина в расплавленную среду роста, не содержащую азота, до конечной концентрации ингибитора, равной 30 или 300 мкМ. Операцию проводили перед переносом целлофана с мицелием на новую чашку Петри с указанной выше средой. Были осуществлены следующие варианты эксперимента - "темнота без ингибитора", "свет без ингибитора", "темнота + ингибитор" и "свет + + ингибитор".
Для каждого штамма N. crassa было поставлено от 7 до 11 биологических параллелей эксперимента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Сравнительные данные по формированию репродуктивных структур в условиях голода по азоту в темноте и после кратковременного освещения мицелия синим светом у различных штаммов N. crassa представлены в табл. 1. В данных усло-
Таблица 1. Образование репродуктивных структур у различных штаммов N. ста&&а в условиях азотного голодания в темноте и после освещения мицелия синим светом
Штамм Протоперитеции, шт/см2 Конидии, 104 шт/см2
темнота свет темнота свет
Дикий тип №0-1 №0-2 691 121 191 1000 97 186 26.8 22.2 19.7 2.0 20.5 18.2
виях эксперимента в клетках дикого типа гриба после освещения наблюдалась стимуляция образования половых структур - протоперитециев, что согласуется с литературными данными [4]. Одновременно происходило сильное ингибирова-ние формирования бесполых спор - конидий [21]. Иная картина наблюдается для штаммов wc-1 и '№0-2 N. ста&ж. Наши результаты подтверждают полученные ранее данные [22], согласно которым для мутантов этого типа не наблюдается фотоиндукции образования протоперитециев и уменьшено их конститутивное формирование в темноте. Клетки мутанта №0-2 образуют протоперите
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.