ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 2, с. 235-242
УДК 581.1
ВЛИЯНИЕ 6-БЕНЗИЛАМИНОПУРИНА НА УРОВЕНЬ МЕТИЛИРОВАНИЯ ЦИТОЗИНОВЫХ ОСТАТКОВ ПРОМОТОРНЫХ ОБЛАСТЕЙ МЕЖГЕННОГО СПЕЙСЕРА рДНК
Triticum aestivum И Triticum urartu
© 2007 г. Б. Е. Сабиржанов, С. М. Бикбулатова, Р. Ä. Фатхутдинова, Ä. В. Чемерис, Ф. М. Шакирова, В. Ä. Вахитов
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, Уфа
Поступила в редакцию 19.07.2006 г.
Исследовали влияние 6-БАП на активацию транскрипции генов рРНК пшениц (Triticum aestivum L. и T. urartu Thum. ex Gandil.) в связи с явлением ядрышкового доминирования и изменением степени метилирования участков межгенного спейсера субгенома А. Методом ПЦР-SSCP (полимеразная цепная реакция-полиморфизма однонитчатых цепей ДНК) проведен анализ фрагментов промотор-ной области рДНК, амплифицированных праймерами, подобранными к предварительно дезаминиро-ванной метабисульфитом натрия ДНК, выделенной из обработанных 6-БАП проростков диплоидной пшеницы T. urartu и гексаплоидной пшеницы T. aestivum. Последующее геномное бисульфитное се-квенирование продуктов амплификации позволило определить уровень метилирования/деметили-рования конкретных цитозиновых остатков. Выявлено вызванное 6-БАП снижение степени метилирования цитозинов промоторных областей рДНК, различающееся у исследованных пшениц, что указывает на зависимость транскрипционной активности генов рРНК разных субгеномов от степени метилирования.
Triticum urartu (диплоидная пшеница) - T. aestivum (гексаплоидная пшеница) - 6-БАП - субгеном А -промоторная область рДНК - ядрышковое доминирование - степень метилирования - ПЦР-SSCP-анализ - геномное бисульфитное секвенирование
ВВЕДЕНИЕ
Избирательное считывание генетической информации, или своевременное включение и выключение генов, контролируется в клетке, в том числе, и эпигенетическими механизмами. Контроль активации генов осуществляется на нескольких уровнях, одним из них является модификация ДНК. Важным эпигенетическим сигналом является метилирование цитозина в молекуле ДНК - модификация, затрагивающая ее структуру, но не нарушающая функций кодирования и копирования [1]. С метилированием ДНК связаны многие физиологические процессы в организмах животных и растений - экспрессия генов, клеточная дифференциация, морфогенез, репли-
Сокращения: МГС - межгенный спейсер; ПЦР - полимеразная цепная реакция; СИТ - сайт инициации транскрипции; ЯОР - ядрышковый организатор; SSCP - полиморфизм однонитчатых цепей (от single strand conformation polymorphism).
Адрес для корреспонденции: Бикбулатова Светлана Магнитов-на. 450054 Уфа, пр. Октября, 71. Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН. Факс: (3472) 35-60-88; электронная почта: mbb@anrb.ru
кация, рекомбинация, инактивация транспозонов и т.п. [2-4].
Известно, что у растений ДНК метилирована в большей степени, чем у животных, и наиболее часто в геноме высших растений встречается 5-ме-тилцитозин, образующийся в результате энзима-тического метилирования нуклеотидов [5]. Цито-зин метилируется преимущественно в дуплетах CG и триплетах CNG, имеющих диадную симметрию [6]; встречается также и асимметричное метилирование [7].
Уже довольно давно отмечена взаимосвязь между метилированием цитозина и уровнем транскрипционной активности генов рРНК: более высокая степень метилирования соответствует более низкому уровню транскрипции генов [8]. Известно также, что от степени метилирования локусов рДНК и структуры хроматина в этих участках зависит их транскрипционный статус. Достаточно хорошо это показано для ди- и полиплоидных видов рода Arabidopsis, являющихся удобными модельными объектами [9]. Не менее подходящими модельными объектами являются ди- и полиплоидные сорта пшеницы. Так, при введении в геном гексаплоидной пшеницы ТгШсит
aestivum хромосомы 1U из Aegilops umbellulata, несущей доминантные гены рРНК, происходит снижение уровня экспрессии генов остальных локу-сов рДНк, что сопровождается увеличением степени метилирования ДНК в этих локусах и уменьшением их чувствительности к обработке ДНКазой I. Аналогичная корреляция была продемонстрирована в опытах с ржано-пшеничными гибридами [10] и противоположная - при делеции у пшеницы ядрышкообразующих хромосом [11].
Дифференциальная экспрессия генов рРНК у полиплоидных пшениц, проявляющаяся в ядрыш-ковом доминировании одних локусов над другими, давно и хорошо известна, однако вызывающие ее причины до сих пор до конца не ясны. Се-квенирование межгенных спейсеров (МГС) рДНК локусов NorB2 и NorD3 (от Nucleolus organizer regions) у гексаплоидной пшеницы T. aestivum, диплоидной пшеницы T. urartu со слабым яд-рышковым организатором (ЯОР) и у Ae. umbellulata, обладающего наиболее сильным ЯОР, позволило обнаружить у этих видов серьезные различия в структурной организации всего МГС [12], а также их промоторной области, включая сайт инициации транскрипции (СИТ) [13], во многом объясняющие феномен ядрышкового доминирования. Однако роль метилирования цитози-нов, находящихся в промоторной области рДНК пшениц, в дифференциальной экспрессии данной генной системы осталась невыясненной, хотя одна из гипотез связывает ядрышковое доминирование, в том числе, и с метилированием цитозино-вых остатков [14]. Ранее мы выявили у T. urartu и Ae. umbellulata отличия в метилировании цитози-новых остатков в рДНК [15]. В других исследованиях изучали роль фитогормонов в процессе метилирования цитозина у пшениц [16] и изменение транскрипционной активности рДНК у араби-допсиса [17]. Однако для полного понимания процесса дифференциальной экспрессии генов рРНК, включающего к тому же роль гормонального баланса, имеющихся сведений все же было недостаточно.
Существует несколько подходов к изучению метилирования нуклеотидов. Один из них основан на обработке ДНК химическими реагентами, специфически взаимодействующими или не взаимодействующими с определенными нуклеотида-ми. К ним, в частности, относится метабисульфит натрия, обработка которым приводит к превращению цитозина в урацил [18]. Для этого используется полимеразная цепная реакция с последующим секвенированием. Кроме того, до сих пор применяется ферментативный метод (расщепление тотальной ДНК рестрикционными эндо-нуклеазами-изошизомерами, различающимися по чувствительности к метилированию цитозино-вых остатков [19]), который позволяет выявить некоторые закономерности, связанные с метили-
рованием цитозина и его ролью в растительной клетке [20, 21]. Используют для этой цели и транскрипционный анализ активности рДНК искусственных гибридов [22].
Цель настоящей работы заключалась в определении характера и степени метилирования ци-тозиновых остатков в промоторных областях межгенного спейсера рДНК субгенома А T. aestivum и субгенома А T. urartu у обработанных и необработанных БАП растений. Выбор объектов обусловлен тем, что T. urartu считается наиболее вероятным донором субгенома А полиплоидных пшениц группы turgidum-aestivum, и было необходимо проследить за изменениями, происходящими в субгеноме A после его интеграции в полиплоидный организм.
МЕТОДИКА
Объект исследования. Опыты проводили на 7-дневных проростках пшеницы Triticum urartu Thum. ex Gandil. и T. aestivum L. Семена после стерилизации 96%-ным этанолом проращивали в течение 6 суток в кюветах на фильтровальной бумаге, смоченной водопроводной водой, при 21-23°С, 16-часовом световом дне и освещенности 15 клк. Затем корни проростков помещали на 24 ч в стаканы с растворами БАП в разных концентрациях.
Выделение ДНК из проростков пшеницы проводили фенольно-детергентным методом [23].
Обработка ДНК метабисульфитом натрия.
Тотальную ДНК расщепляли эндонуклеазами рестрикции, не имеющими сайтов в исследуемом участке МГС рДНК, для уменьшения размеров фрагментов ДНК и обеспечения максимально полной денатурации цепей. 2-6 мкг расщепленной ДНК растворяли в 10-40 мкл воды, добавляли 5 М NaOH до конечной концентрации 0.2 М и проводили денатурацию при 42°C в течение 15 мин. К денатурированной ДНК добавляли свежеприготовленный раствор, содержащий 2.5 M метаби-сульфита натрия (Na2S2O5) и 100 мМ гидрохинона (из расчета 200 мкл раствора на 1 мкг ДНК), перемешивали и наслаивали сверху минеральное масло.
Обработку ДНК проводили при 55°C в течение 4 ч, далее переносили реакционную смесь в новую пробирку, исключая минеральное масло, и охлаждали на льду. После этого к 1 объему реакционной смеси добавляли 0.5 объема ацетата натрия, 2 объема воды и 400 мкг декстрана T70. ДНК осаждали изопропиловым спиртом (1 объем) и центрифугировали в течение 10 мин при 14000 g. Осадок растворяли в 0.3 М растворе ацетата натрия и осаждали двумя объемами этилового спирта при -70°C. Для полного избавления от сульфитов осадок растворяли в 0.2 М NaOH и осаждали этиловым спиртом (2 объема), добавив к смеси 0.5 объема ацетата аммония, при -70°C [24].
После центрифугирования осадок растворяли в 60 мкл воды и анализировали электрофоретиче-ски в агарозном геле. Далее обработанную таким образом ДНК использовали для анализа методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Полимеразная цепная реакция. ПЦР проводили в 30 мкл смеси, содержащей 67 мМ Трис-HCl (рН 8.9), 16.6 мМ (NH4)2SO4, 1.5 мМ MgCl2, 0.01% Tween-20, 0.1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по 200 мкМ дАТФ, дЦТФ, дТТФ, дГТФ и 1 ед. Taq ДНК-полимеразы. Режим амплификации: 94°С - 2 мин; затем 20-30 циклов: денатурация при 94°С - 40 с; отжиг праймеров при 55°С - 1 мин; элонгация при 72°С - 1 мин; заключительное достраивание цепей ДНК при 72°С -4 мин. Продукты амплификации (10-20 мкл) фракционировали электрофорезом в 1.0-1.5%-ном агарозном геле в буфере ТАЕ (40 мМ Трис-HCl, 20 мМ ацетат, 2 мМ эДТА, рН 7.6) при 10 V/см в течение 1-2 ч. В качестве маркера использовали ДНК плазмиды pBluescript II KS(-), расщепленную рестриктазой MspI.
Олигонуклеотидные праймеры. Нуклеотид-ная последовательность прямого праймера meth 1 (5'-ACCTAAACTAACTCCCAAAAAACCA-3') комплементарна участку МГС рДНК различных представителей трибы пшениц с геномом А, находящемуся в нетранскрибируемой части (рис. 1). Обратны
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.