^^^^^^^^^^^^ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ
СТАТЬИ
581.1
ВЛИЯНИЕ АБСЦИЗОВОЙ КИСЛОТЫ НА ФЕНОЛЬНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК Onosma paniculatum
© 2007 г. Д.-Й. Сун*, З.-Дж. Ин*, Ш.-Дж. By*, Дж. Си*, Ш. Ши*, X. By**, Ф.-Х. Сяо***, Дж.-Л. Ци*, З. Лиу*, Й.-Дж. Пан*, Х.-Г. Шен*, Й.-X. Ян*
* Школа естественных наук, Университет Нанкина, Нанкин, Китай ** Университет традиционной китайской медицины Нанкина, Нанкин, Китай *** Юньнаньский сельскохозяйственный университет, Куньмин, Китай Поступила в редакцию 27.03.2006 г.
Исследовали влияние АБК на рост и вторичный метаболизм культивируемых клеток Onosma paniculatum. Добавление 0.1-5.0 мг/л АБК в питательные среды В5 и М9 замедляло рост клеток, а при культивировании в среде М9 снижало синтез шиконина и его производных в ходе всего процесса культивирования. Присутствие 0.1 мг/л АБК приводило к значительному снижению активности фе-нилаланин аммиак-лиазы и геранилтрансферазы n-гидроксибензойной кислоты, соответственно первого и ключевого ферментов биосинтеза шиконина, на 4-е сутки после инокуляции. Однако не было обнаружено достоверных изменений активности этих ферментов через 8, 12 и 16 суток культивирования. Данные ОТ-ПЦР анализа (обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция) не позволяют говорить о значительном изменении экспрессии генов PAL1 и LePGT на 4-е сутки после инокуляции. Более того, влияние АБК на вторичный метаболизм культивируемых клеток могло быть снято добавлением 2-аминоэтилдифенил бората, ингибитора рецептора инозитолтрифосфа-та, или никотинамида, ингибитора АДФ-рибозилциклазы, действие которого связано со снижением внутриклеточной концентрации кальция.
Onosma paniculatum - Boraginaceae - АБК - культура in vitro - вторичный метаболизм - производные шиконина
ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 4, с. 597-603
УДК
ВВЕДЕНИЕ
Известно, что в ходе развития растения АБК участвует в регуляции ряда важнейших событий и физиологических процессов, таких как созревание семян, прорастание, синтез запасных белков и липидов семени, закрытие устьиц, ответные реакции при патогенезе и индукция устойчивости [1-4]. В одних случаях ответную реакцию на воздействие АБК можно наблюдать уже через несколько минут, как, например, это происходит при закрытии устьиц, когда АБК индуцирует быстрое увеличение концентрации кальция в замыкаю-
Сокращения: ОТ-ПЦР - обратная транскрипция-полиме-разная цепная реакция; ФАЛ - фенилаланин аммиак-лиаза; ПГБ-геранилтрансфераза - геранилтрансфераза n-гид-роксибензойной кислоты; АДБ - 2-аминоэтилдифенил борат; цАДФР - циклическая АДФ-рибоза; IP3 - инозитол-1,4,5-трифосфат.
Адрес для корреспонденции: Y.-H. Yang. State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, Plant Cell Physiology and Molecular Biology Laboratory, Department of Biological Science and Technology, School of Life Sciences, Nanjing University, 22 Hank-ou Road, Nanjing 210093, China. Fax: 862-58-3686305; e-mail: YangYH@nju.edu.cn
щих клетках [5, 6]. В других случаях влияние АБК проявляется спустя длительный период времени и связано с регуляцией различных генов и белков. Например, прорастание семян томатов АБК ин-гибирует опосредованно, через снижение активности маннаназы [7]. Однако большая часть реакций, индуцируемых АБК, протекает с участием одних и тех же посредников, вторичных мессен-джеров, включая Ca2+, циклическую АДФ-рибозу (цАДФР), инозитол-1,4,5-трифосфат (IP3) и фос-фолипазы [5, 8]. АБК оказывает неоднозначное влияние на вторичный метаболизм культивируемых растительных клеток. Например, присутствие АБК усиливало образование паклитаксела в суспензии клеток Taxus chinensis [9] и в то же время значительно снижало содержание сапонина в культуре "бородатых корней" (hairy root culture) Panax quinquefolium [10].
Большая часть исследований сфокусирована на изучении влияния АБК на рост растений, ее участии в процессах созревания семян и закрытия устьиц. В то же время данные о влиянии АБК на вторичный метаболизм растений нельзя назвать исчерпывающими. Целью данной работы было изучить воздействие АБК на вторичный метабо-
лизм культивируемых клеток Onosma panicula-tum. При наличии четких представлений о путях биосинтеза шиконина и доступной методики количественной оценки его содержания [11-13] эта культура становится многообещающей модельной системой для биохимических исследований регуляции вторичного метаболизма растений и способов передачи сигнала. Кроме того, вторичные метаболиты клеток O. paniculatum, шиконин и его производные, имеют важное значение для медицины. Показано, что шиконин способен угнетать развитие вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1), ингибировать размножение и миграцию эндотелиальных клеток in vitro, а у мышей - также ингибировать ангиоге-нез, индуцированный TNF-a и Вб-меланомами [14, 15].
МЕТОДИКА
Растительный материал. В работе использовали каллус линии YN121, полученный из молодых побегов Onosma paniculatum [16]. Культивирование осуществляли по разработанной ранее [12] двухступенчатой схеме: на стадии экспоненциального роста клетки культивировали на агаризо-ванной среде В5, а после перехода в стационарную фазу, в течение которой происходил синтез шиконина и его производных, клетки выращивали в жидкой среде М9. На стадии экспоненциального роста клетки культивировали при 25°C, интенсивности освещения 4 клк и 8-часовом фотопериоде с субкультивированием каждые 18 суток до того момента, когда каллус вступал в стационарную фазу. На второй стадии 2.5 г каллуса ино-кулировали в 250-миллилитровые колбы Эрлен-мейера, содержавшие по 50 мл среды М9 и культивировали на круговой качалке со скоростью 120 об./мин в темноте при 25°C. В начале культивирования в среды В5 и М9 добавляли АБК, 2-амино-этилдифенил борат (АДБ) или никотинамид в различных концентрациях. Маточные растворы этих веществ стерилизовали фильтрованием через 0.2-микромолярные фильтры и хранили в стерильных пробирках Фалькона объемом 15 мл.
Кривые роста культуры клеток и определение содержания шиконина. Сырой вес клеток, культивируемых на средах В5 и М9, определяли в начале культивирования (0 ч) и затем в течение 16 суток с интервалами в 4 суток. Относительное изменение сырого веса рассчитывали как отношение разницы сырого веса клеток в нулевой и выбранный момент времени к начальному сырому весу [16]. Содержание шиконина и его производных в клетках определяли, как описано в работе Heide и Tabata [17]. Для получения экстракта 1 г каллуса, культивируемого на среде M9, обрабатывали 5 мл петролейного эфира. Спустя двое суток экстракт отделяли и хранили в 50-милли-
литровых пробирках при 4°C. Затем снова проводили экстракцию в 5 мл петролейного эфира. Процесс экстракции повторяли, пока экстракт не становился бесцветным. Супернатант от всех экстракций объединяли, и объем доводили петро-лейным эфиром до 25 мл. Шиконин является основным компонентом экстракта культивируемых клеток, поэтому его использовали для построения калибровочной кривой. Измерения абсорбции проводили при 520 нм.
Определение активности ферментов. Для получения свободного от клеток экстракта ферментов каллус весом 0.5 г (сырой вес) суспендировали в 0.1 M калий-фосфатном буфере (1.5 мл, pH 6.5), содержавшем 10 мМ дитиотрейтол, 1 мМ фенил-метилсульфонил флуорид, 1 мкМ леупептин и 5%-ный поливинилпирролидон. Смесь гомогенизировали при 4°С, затем центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин. Супернатант использовали для анализа активности ферментов. В 100 мкл реакционной смеси для определения активности фенилаланин аммиак-лиазы (ФАЛ, КФ 4.3.1.5) содержался 10 мкМ боратный буфер (pH 8.7), 4 мкМ L-фенилаланин и 80 мкл экстракта фермента. После инкубации при 0°C в течение 60 мин реакцию останавливали добавлением 5 мкл HClO4. Продуктом реакции являлась коричная кислота, поэтому активность ФАЛ выражали в мкг коричной кислоты/г сырого веса клеток [18]. Активность геранилтрансферазы я-гидроксибензойной кислоты (ПГБ-геранилтрансферазы) определяли с помощью ВЭЖХ. 100 мкл реакционной смеси содержали 10 мкМ Трис-HCl (pH 7.5), 0.01 мкМ ПГБ, 0.2 мкМ геранилпирофосфат, 1 мкМ MgCl2 и 80 мкл экстракта фермента. После инкубации при 30°C в течение 60 мин реакцию останавливали добавлением 5 мкл HCO2H и проводили экстракцию в 150 мкл этилацетата. 100 мкл этилаце-тат-растворимой фракции отделяли под низким давлением и перерастворяли в 100 мкл метанола. На анализ методом ВЭЖХ отбирали образец объемом 5 мкл. ВЭЖХ проводили при следующих условиях: колонка Hypersil BDS C8 (4.6 х 150 мм); растворители вода : метанол : H3PO4 (800 : 200 : 1); детекция при 255 нм. Активность ПГБ-геранил-трансферазы выражали в мкг усвоенной ПГБ/г сырого веса клеток [18].
Выделение общей РНК и проведение RTOT-PCR ПЦР анализа (обратная транскрипция-по-лимеразная цепная реакция). РНК экстрагировали из клеток по методу GTC [19]. Концентрацию РНК определяли на спектрофотометре U-3000UV ("Hitachi", Япония). 1 мкг общей РНК использовали для синтеза кДНК по методике, прилагаемой к набору реагентов Reverse Transcription System ("Promega", США). 20 мкл реакционной смеси для ПЦР содержали 0.5 мкл смеси для обратной транскрипции, 2 мкл 10Х ПЦР-буфера, по 60 пмоль каждого праймера, 0.2 м М дНТФ, 1.5 мМ MgCl2 и
3.0
М25
о 2.J н
о
3 2.0
я!
§1.5
о
¡3 1.0 ° 0.5
_I
CK 0.1 0.5 1.0 Концентрация АБК, мг/л
5.0
70 60
I g50
S £ *§40
к &30
■ л
л о
* -ъ.
ем и л о
О
4 8 12
Сутки после инокуляции
16
Рис. 1. Влияние АБК на рост клеток O. paniculatum, культивируемых на средах В5 и М9. Представлены средние значения из трех повторно-стей и их стандартные ошибки. 1 - среда В5, 2 - среда М9.
1.5U Taq-ДНК полимеразы ("Promega"). ПЦР проводили в аплификаторе GeneAmp(r) 9700 Thermal Cycler по следующей программе: денатурация при 94°C 3 мин, затем 30 циклов (30 с 94°C, 30 с при 55°C и 45 с при 72°C), удлинение цепи при 72°C 5 мин. 10 мкл продуктов ПЦР разделяли электрофоретически в 1.2%-ном агарозном геле с бромистым этидием.
Клонированные цепочки кДНК и праймеры: ген GAPDH - для прямой транскрипции 5' GGGTGGTGCTAAGAAGGTTGTC3' и для обратной транскрипции 5' CACGAGAGCTGTACCCAT
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.