ФИЗИОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА, 2004, том 30, № 2, с. 117-121
УДК 612(047)+612.111
ВЛИЯНИЕ АДСОРБИРОВАННЫХ ПРОТЕИНОВ НА РЕОЛОГИЧЕСКИЕ
ХАРАКТЕРИСТИКИ ЭРИТРОЦИТОВ
© 2004 г. И. Ю. Смирнов, В. Н. Левин
Ярославский государственный педагогический университет им. К.Д. Ушинского
Поступила в редакцию 20.05.2002 г.
Проведено исследование адсорбционных характеристик красных клеток крови с применением метода импедансной спектроскопии в области радиочастот. Параллельное исследование текучести концентрированных суспензий эритроцитов выявило тесную взаимосвязь между величиной адсорбции протеинов на эритроцитарных мембранах и силой взаимодействия клеток в потоке. Повышенная адсорбция высокомолекулярных протеинов и существенно сниженная текучесть суспензий красных клеток крови отмечена в группе с патологией периферического кровообращения, что позволяет предполагать участие адсорбционных процессов в качестве механизма возникновения реологических нарушений.
Поведение эритроцитов в потоке определяется двумя основными процессами - агрегацией и деформацией [1]. Образование агрегатов традиционно ассоциируется с наличием высокомолекулярных протеинов в плазме и величиной поверхностного заряда клеток [2]. Высокомолекулярные белки, такие как фибриноген и макроглобулины, обеспечивают образование молекулярных мостиков между клетками. Снижение величины поверхностного заряда приводит к ослаблению сил взаимного отталкивания [3]. Для создания мостиковых связей высокомолекулярные белки должны иметь возможность образовывать слабые связи с гидрофильными участками интегральных белков мембран [4]. Однако такие же связи способны образовывать и сравнительно низкомолекулярные протеины. При этом линейные размеры их молекул оказываются меньше критического расстояния сближения, обусловленного поверхностным зарядом. Таким образом, адсорбция высокомолекулярных протеинов инициирует процесс агрегации, а адсорбция низкомолекулярных белков его ингибирует. Кроме того образование белковой сети на поверхности клеток приводит к изменению вязко-эластических свойств мембран и таким образом сказывается и на деформируемости клеток [5].
МЕТОДИКА
Теоретические основы дисперсионного поведения крови в области радиочастот были достаточно хорошо разработаны во второй половине двадцатого столетия [6, 7]. В настоящее время Р-дисперсия описывается моделью неоднородных диэлектриков Максвелла-Вагнера. При практическом применении методов кондуктометрии для измерения объема фракции клеток используется
ряд теоретических допущений, упрощающих модель. К числу таких допущений относится тезис о незначительности влияния поверхности эритроцитов на проводимость суспензии в области низких частот. Однако анализ механизмов, участвующих в обеспечении проводимости, показывает, что это допущение справедливо лишь в области малых величин гематокритного показателя. При проведении измерений на концентрированных суспензиях влияние мембраны на проводимость оказывается достаточно заметным. Это связано с тем фактом, что объем проводящей среды и расстояния между клетками в измерительной ячейке оказываются малыми и влияние мембранных протеинов на подвижность ионов в межклеточном пространстве становится доступным для регистрации.
При исследовании электрических свойств материалов возможно проведение измерений диэлектрической проницаемости, проводимости и импеданса. В радиоэлектронике проведение измерений активной и реактивной составляющих проводимости не представляет серьезных проблем, особенно, при использовании уравновешенных мостов. Однако при проведении измерений на биологических объектах результаты подобных измерений не могут быть так же легко интерпретированы. Наиболее важным фактором, усложняющим анализ результатов измерений, является наличие поляризационных эффектов на электродах [8, 9]. Конкретный вклад поляризационных эффектов в измеряемые величины активной и реактивной составляющей зависит от конструктивных особенностей измерительной ячейки и условий проведения измерений. При этом конструкция ячейки и используемых электродов позволяют изменять соотношение вклада емкост-
кОм 180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
А
Б
1 10 100 300 5001000 кГц 1 10 100 300 500 1000 кГц
Рис. 1. Динамика импеданса образцов плазмы, фосфатного буферного раствора, концентрированных суспензий на-тивных и отмытых эритроцитов.
А - динамика импеданса плазмы и концентрированных суспензий нативных эритроцитов. Б - динамика импеданса фосфатного буфера и концентрированных суспензий отмытых эритроцитов. По оси ординат - импеданс, кОм; по оси абсцисс - частота, кГц.
ного и резистивного компонентов в результат измерений [10]. После серии экспериментальных работ с камерами, имеющими величину постоянной от 0.05 до 600 см-1, предпочтение было отдано ячейке с постоянной 52 см-1. Применение такой ячейки позволило достичь приемлемого компромисса между погрешностями, вносимыми в результат измерений, поляризационными эффектами на электродах и погрешностями широкополосного измерителя импеданса.
В серии широкополосных измерений различных образцов крови нами была зарегистрирована выраженная дисперсия в диапазоне от 1 до 1000 кГц. Однако анализ результатов измерений показал, что в диапазоне до 100 кГц снижение величины импеданса в основном было связано со снижением поляризации на электродах. Относительная величина снижения была практически одинакова при измерениях на растворах электролитов, белковых растворах, плазме крови и суспензиях клеток. Следовательно, дисперсия, обусловленная влиянием клеток, оказывалась наиболее существенной в области выше 100 кГц. При этом наибольшие различия между образцами клеток были отмечены в области 100-500 кГц и практически исчезали к частоте 1 мГц (рис. 1). На основании этих результатов дальнейшие измерения проводились только на двух частотах: 100 кГц - частота с минимальной величиной истинной Р-дисперсии [11] и 300 кГц - частота в области выраженной Р-дисперсии. Все измерения выполнены в термоста-тируемой ячейке при 37°С. В качестве среды тер-
мостата использовано трансформаторное масло, имеющее малую величину диэлектрической проницаемости.
Кровь для исследований получали от двух групп добровольцев. Контрольную группу составили женщины в возрасте от 25 до 45 лет, не имеющие субъективных жалоб на состояние здоровья (13 человек). Вторую группу составили 32 пациентки с клинически поставленным диагнозом -ревматоидный артрит. Кровь для исследования у данной группы брали при поступлении в стационар. Возраст пациенток составлял 35-45 лет.
Для проведения измерений использовались концентрированные суспензии нативных и трижды отмытых в фосфатном буфере (рН - 7.4: осмо-лярность- 300 мосм/л) эритроцитов. Концентрированную суспензию клеток получали центрифугированием в течение 15 мин при 1000^. После тщательного удаления супернатанта для измерений использовали нижнюю часть фракции клеток. Контроль величины гематокритного показателя для измеряемого образца осуществлялся дополнительным центрифугированием в 100 мм капилляре в течение 30 мин при 1000^. Относительно малая величина ускорения использована с целью минимизации гравитационных воздействий на мембраны клеток, а суммарное время центрифугирования 45 мин позволяло получать величину гематокритного показателя, такую же как и при применении гематокритной микроцентрифуги (7 мин при 10.000^).
С целью выявления влияния адсорбированных белков выполнялась вискозиметрия концентрированных суспензий нативных и трижды отмытых в фосфатном буфере клеток. Измерения выполнены на оригинальном капиллярном вискозиметре с автоматическим электронным измерительным блоком, при температуре 37°С. Виско-зиметрические измерения проводились с тем же образцом, что и при импедансометрии.
Определение общей концентрации белков проводилось фотоколориметрически по биурето-вой реакции. Разделение белков на фракции выполняли электрофорезом на бумаге. Концентрацию фибриногена измеряли суховоздушным методом по Рутбергу.
Статистическая обработка результатов проведена в соответствии с рекомендациями [12], с применением непараметрического ¿/-критерия Ман-на-Уитни и корреляции Спирмена компьютерной программы Stadia.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Измерение величины импеданса на частоте 100 кГц выявило существенные различия между удельными импедансами нативных клеток в группе больных и в контрольной - 1820 ± 182 и 1620 ± ± 140 Ом ■ см соответственно (p < 0.0004). При этом величина гематокритного показателя в обеих группах была практически одинаковой (0.990 ± ± 0.007 и 0.987 ± 0.009). Было выявлено различие между группами в величине удельного импеданса плазмы, которое на частоте 100 кГц составило в группе больных 68.7 ± 2.4 и 67.0 ± 2.8 Ом ■ см в группе контроля (p < 0.0002). При проведении измерений импеданса нативных клеток на частоте 300 кГц статистически достоверных различий между группами не выявлено (при среднегруппо-вых величинах в группе больных 871 ± 57.5 Ом ■ см и в контрольной группе 844 ± 49 Ом ■ см).
После выполнения трехкратной отмывки в фосфатном буфере средняя величина удельного импеданса суспензий в группе контроля составила на частоте 100 кГц - 1240 ± 123 Ом ■ см, а на частоте 300 кГц - 746 ± 46 Ом ■ см. В группе больных соответствующие величины были равны 1150 ± ± 160 и 719 ± 60 Ом ■ см. Среднегрупповая величина гематокритного показателя концентрированных суспензий отмытых клеток в группе контроля была 0.990 ± 0.007, а в группе больных - 0.988 ± ± 0.009. Статистическая обработка результатов не выявила достоверных различий в импедансах суспензий между группами ни на 100 кГц, ни на 300 кГц.
Вискозиметрия концентрированных суспензий нативных клеток продемонстрировала существенные различия между группами. Если в контрольной группе величина вязкости составила
Общая концентрация белков и отдельных фракций
Белковые фракции, г/л Контроль Ревматоидный артрит Достоверность различий
Общая концен- 78.0 ± 5.4 84.0 ± 6.9 p < 0.0001
трация
Альбумины 40.0 ± 4.3 41 ± 5.8 p < 0.09
Фракция ах 4.6 ± 1.5 5.0 ± 1.4 p < 0.027
Фракция а2 6.5 ± 1.4 7.8 ± 1.6 p < 0.0008
Фракция в 10.4 ± 2.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.