ОНТОГЕНЕЗ, 2012, том 43, № 4, с. 278-286
КЛЕТОЧНАЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКА И ПРОЛИФЕРАЦИЯ
УДК 576.35
ВЛИЯНИЕ АКТИВАТОРА И ИНГИБИТОРОВ Са2+-КАНАЛОВ НА ПРОЛИФЕРАТНУЮ АКТИВНОСТЬ ИНФУЗОРИЙ
Tetrahymena pyriformis
© 2012 г. И. В. Шемарова*, Г. В. Селиванова, Т. Д. Власова
Институт цитологии РАН, 194064 Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4 *Институт эволюционной физиологии и биохимии имени И.М. Сеченова РАН, 194223 Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, д. 44 Поступила в редакцию 04.05.10 г.
Окончательный вариант получен 23.08.11 г.
Установлено, что у инфузорий T. pyriformis под действием активатора (кофеина) и ингибиторов Са+-каналов (верапамила), NiCl2 и CdCl2 происходит изменение содержания ДНК в макронуклеусах. Кофеин (10 мМ) стимулирует синтез ДНК. Верапамил (5 мкМ), CdCl2 (125 мкМ), NiCl2 (100 мкМ) понижают содержание ДНК в макронуклеусах уже к 30 мин после пролиферативной стимуляции. К 4 ч инкубации в макронуклеусах тетрахимен, предобработанных верапамилом, содержится в среднем на 10% меньше ДНК, чем в контрольных клетках. Клетки, предобработанные CdCl2 и NiCl2, отличаются от контрольных более низким содержанием ДНК практически на всех исследуемых сроках, но к 4 ч, восстанавливают уровень ядерной ДНК. Предполагается, что передача пролиферативных сигналов у T. pyriformis носит Са2+-зависимый характер.
Ключевые слова: Tetrahymena pyriformis, внутриклеточная сигнализация, пролиферация, Ca2+, кофеин, верапамил, Cd2+, Ni2+, клеточный цикл.
Одноклеточные микроорганизмы представляют собой типичный пример системы с индуцированным синтезом ДНК и являются удобным объектом для изучения механизмов передачи и реализации митогенного сигнала в клетках эукариот.
В предыдущем исследовании мы обнаружили различия в действии кофеина на Tetrahymena pyri-formis, стимулированные и не стимулированные эпидермальным фактором роста (ЭФР). Тогда же было показано, что ингибиторы PLC и PKC (соединение U73122 и хелететрин соответственно) существенно замедляют скорость синтеза ДНК (Шемарова и др., 2008). В клетках позвоночных животных действие PLC и PKC на пролиферацию связывают, прежде всего, с их способностью фос-форилировать субстраты, изменение активности которых в свою очередь влияет на активность Са2+-зависимых МАР-киназ (Heo et al., 2006; Lee et al., 2006). У одноклеточных изменение активности Са2+-зависимых киназ, вызванное повышением концентрации ионов Ca2+, также является индуктором различных программируемых процессов (Шемарова, Нестеров, 2005), включая пролиферацию (Roisin et al., 2000). В связи с вышеизложенным, нам представлялось важным продолжить начатые исследования и выяснить, каким образом повлияет на синтез ДНК предобработка T. pyriformis активатором и ингибиторами Са2+-каналов.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Экспериментальная часть работы была выполнена на инфузориях Tetrahymena pyriformis (амик-ронуклеусный штамм GL), выращиваемых аксе-нически при 28°С в среде следующего состава: 100 мг/л NaCl, 10 мг/л KCl, 10 мг/л CaCl2 и MgCl2, 20 мг/л NaHCO3, 1 г/л сухого экстракта бычьей печени ("Difco", США), 15 г/л пептона (Richter, Венгрия), 2 г/л сухого дрожжевого экстракта ("Serva", Германия) и 0.1 мл/л трисульфона. Условия выращивания клеток описаны ранее (Шема-рова и др., 2002). В качестве исходной использовали 48-часовую культуру, в которой клетки находились в стационарной фазе роста (Ирлина, Меркулова, 1975). В опытные пробы объемом 5.0 мл добавляли 0.01 мл тестируемых веществ: 500 мМ кофеина, 2.5 мМ верапамила, 50 мМ хлористого никеля, 62.5 мМ хлористого кадмия. Пробы инкубировали 30 мин при 28°С, затем центрифугировали 5 мин при 2000 об/мин, после чего отмывали от веществ минеральной средой Лозина-Лозинского и повторно центрифугировали при тех же условиях. К осадку опытных и контрольных клеток объемом 0.3 мл добавляли 0.7 мл свежей питательной среды (СПС). Сразу после добавления СПС 0.05 мл культуры из контрольной пробы фиксировали на предметном стекле (два микропрепарата) для последующего определения содержания ДНК в ядрах тетрахимен в
Влияние кофеина и ингибиторов Са2+-каналов на содержание ДНК (отн. ед.) в ядрах ТвШкутвпа руп/огт1$
Сроки фиксации клеток, ч Контроль Верапамил Кофеин са2+ №2+
0 4.87 ±0.16 - - - -
0.5 5.48 ± 0.16 4.75 ± 0.18 6.69 ± 0.16 4.53 ± 0.18 4.78 ± 0.15
1.0 5.54 ± 0.14 5.16 ± 0.15 6.69 ± 0.20 4.73 ± 0.17 5.44 ± 0.14
1.5 5.82 ± 0.14 4.68 ± 0.14 6.30 ± 0.17 5.24 ± 0.17 5.43 ± 0.19
2.0 5.44 ± 0.13 5.26 ± 0.14 6.35 ± 0.18 5.32 ± 0.16 4.59 ± 0.14
2.5 5.02 ± 0.15 5.62 ± 0.15 7.28 ± 0.18 5.15 ± 0.16 4.98 ± 0.15
3.0 6.00 ± 0.17 5.75 ± 0.15 6.34 ± 0.19 5.26 ± 0.18 5.24 ± 0.15
3.5 5.24 ± 0.15 5.03 ± 0.15 5.69 ± 0.14 6.12 ± 0.18 5.44 ± 0.16
4.0 5.40 ± 0.19 4.79 ± 0.16 7.51 ± 0.16 5.82 ± 0.19 5.35 ± 0.15
стартовой точке (0 мин). В дальнейшем отбор и фиксацию опытных проб проводили через каждые 30 мин на протяжении 4 ч культивирования тетрахимен при 28°С. Измерение содержания ДНК проводили в фиксированных жидкостью Карнуа и окрашенных по Фельгену микропрепаратах методом одноволновой абсорбционной цитофотометрии с использованием ядерных зондов диаметром 4, 6, 8 и 10 мкм. При этом измеряемые ядра инфузорий вписывались целиком в подобранные к их размеру зонды. Основная масса ядер вписывалась в зонды диаметром 6, 8 и 10 мкм. Фотометрирование ядер производилось при 550 нм с использованием 50х объектива. Содержание ДНК определяли по формуле: О = Б х Б, где Б — оптическая плотность, создаваемая в пределах описывающих его зонда, а Б — площадь зонда.
Данные представлены в виде среднеарифметических значений и их ошибок, вычисленных по результатам измерения содержания ДНК в 100 клетках с обозначением доверительного интервала (х ± Sx). Достоверность различия средних оценивали по ¿-критерию Стьюдента.
В работе использовали неорганические соли производства "Вектон" (Санкт-Петербург).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Действие кофеина. В данных экспериментах мы изучали митогенное действие кофеина (10 мМ) на клетки, индуцированные к росту путем их переноса в СПС. В концентрации 10 мМ кофеин стимулировал синтез ДНК (таблица). Увеличение синтеза ДНК в опытных культурах отмечали уже через 0.5 ч от начала эксперимента. При этом относительное содержание ДНК в клетках, прединкубированных с кофеином, относительно контроля составило 122%. Повышенное содержание ДНК в опытных пробах отмечали практически на протяжении всего периода на-
блюдения (7 сроков из 8), причем на сроках 2.5 и 4 ч наблюдали наличие двух максимумов в содержании ДНК, превышающие максимум в контроле на 21 и 25% соответственно.
Из гистограмм распределения клеток по содержанию ДНК видно следующее. Во-первых, под действием кофеина по сравнению с контролем происходит более массовое и раннее вступление клеток в фазу 02 клеточного цикла, что может
14 12 10 8 6 4 2
18 16 14 12 10 8 6 4 2
(а)
ш
(б)
н ш еч шт ш ^
1П ЧО
Ш ОШ-НЩ
Ол
02
Рис. 1. Распределение клеток Т. pyriformis по содержанию ДНК без обработки (а) и после их предобработки 10 мМ кофеином через 0.5 ч после культивирования в СПС (б).
По оси абсцисс — содержание ДНК, отн. ед. По оси ординат — количество клеток, % (для рис. 1—5).
0
0
18 16 14 12 10 8 6 4
(а)
j_I_I_L_
_i_I_I_I_I
О Г* С^. ^ ^ ЧО ^ С^^О^^М
(б)
18 16 14 12 10 8 6 4
J_I_I_I_I_I_L
H]
0m ^to ^to^ СЛ^.о1^.
ö т-i t№ m' rn' чо оо сл^о
Lt
G,
G2
Рис. 2. Распределение клеток Т. pyriformis по содержанию ДНК без обработки (а) и после их предобработки 10 мМ кофеином через 2.5 ч после культивирования в СПС (б).
2
0
2
0
свидетельствовать о его синхронизирующем и митогенном действии на тетрахимен (рис. 1а, 1б). Во-вторых, под действием кофеина клетки быстрее вступают в фазу синтеза ДНК и соответственно в фазу деления. На это указывает распределение опытных и контрольных клеток по фазам клеточного цикла на сроке 2.5 ч (рис. 2а, 2б). Из данных гистограммы видно, что на этом сроке большая часть популяции опытных клеток находилась в фазах 02/Б и 02, в то время как контрольные клетки — в фазах б^/Б и Б. Лишь к 3-м ч в контрольной популяции стали появляться клетки, характеризующиеся удвоенным, постсинтетическим количеством ДНК в фазе 02. В-третьих, под действием кофеина происходит более раннее вступление клеток во второй клеточный цикл, на что указывает большее по сравнению с контролем количество опытных клеток, перешедших в фазу 02 клеточного цикла к 4-м ч культивирония (данные не показаны).
Полученные данные говорят о том, что в пороговых концентрациях кофеин стимулирует синтез ядерной ДНК у T. pyriformis. В литературе имеются примеры, свидетельствующие о митогенном действии физиологических концентраций кофеина на клетки. В частности, отмечено, что воздействие 20 мМ кофеина на первичную культуру стромальных клеток простаты стимулирует пролиферацию (Wu et al., 2005). Сходный эффект кофеина выявлен и в отношении небласттрансфор-мированных клеток млекопитающих (Chiarella, Puglisi, 2004; Sacks et al., 2008), почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Martin et al., 2000; Kim et al., 2008), инфузорий Tetrahymena thermophila (Yakisich et al., 2006) и бактерий (Lawrence et al., 2005). В то же время имеются указания и на возможность ингибирующего действия кофеина на рост клеток разных типов (Isfort et al., 1996; Desfrere et al., 2007), в том числе и клеток низших эукариот (Yeung et al., 2006).
16 14 12 10 8 6 4 2
(а)
Д
о t№ со to чо оо сК^о
О
14 г
12 10 8 6 4 2 0
(б)
XI
т
0
°1 °2
Рис. 3. Распределение клеток T. pyriformis по содержанию ДНК до и после их предобработки 5 мкМ верапамилом (а) и 125 мкМ хлористым кадмием (б) через 0.5 ч после культивирования в СПС.
Механизм митогенного действия кофеина на клетки преимущественно связывают с его Са2+-мобилизующей функцией и коактивацией проли-феративных сигнальных путей, зависимых от кальциевого сигнала. На это указывает корреляция между степенью стимуляции рецепторов факторов роста, внутриклеточной концентрацией Са2+ и активностью протеинкиназ (Ragel et al., 2007; Furuhashi et al., 2008; Ge et al., 2009). Инги-бирующий эффект кофеина на рост клеток может быть обусловлен как его воздей
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.