ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2013, том 453, № 1, с. 109-113
КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 576.3/7: 577.17.02
ВЛИЯНИЕ АЛЬФА-МЕЛАНОЦИТСТИМУЛИРУЮЩЕГО ГОРМОНА НА НАЧАЛЬНЫЕ СТАДИИ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК МЫШИ
© 2013 г. Е. С. Мануилова, Е. Л. Арсеньева, Е. В. Новосадова, И. А. Гривенников, академик Н. Ф. Мясоедов
Поступила в редакцию
БОТ: 10.7868/80869565213230266
Альфа-меланоцитстимулирующий гормон (аль-фа-МСГ) относится к семейству меланокортинов, которое включает в себя адренокортикотропный гормон (АКТГ), альфа-, бета-, гамма-МСГ и ряд более коротких пептидов [1]. Известно, что мелано-кортины и их фрагменты обладают ноотропным, нейропротекторным и нейротрофическим действием [2, 3]. Положительный эффект меланокортинов, который наблюдали в культуре нейронов крысы, выражался в повышении выживаемости нейронов, увеличении прорастания отростков и экспрессии нейрон-специфического белка В-50 [4]. Альфа-МСГ стимулировал прорастание отростков в клетках нейробластомы Neuro 2A, причем введение антагониста меланокортиновых рецепторов (MCR4) D-АргБ АКТГ4-10 ингибирова-ло положительный эффект пептида [5].
В работе Brannvall [6] исследовали эффект аль-фа-МСГ на пролиферацию клеток, полученных из эмбрионального мозга крысы. Было показано, что введение альфа-МСГ приводило к увеличению пролиферативной активности и образованию вторичных нейросфер в 2 раза по сравнению с контролем, что указывало на стимулирующее действие альфа-МСГ на способность клеток к самообновлению. Ранее было обнаружено, что Семакс (Met—Glu— His—Phe—Pro—Gly— Pro), являющийся синтетическим аналогом фрагмента АКТГ4-10, увеличивал выживаемость нервных клеток в эмбриональных культурах мозга крысы в несколько раз [7]. Введение альфа-МСГ и семакса в первичные культуры нейронов и астроцитов гиппокампа крысы приводило к увеличению уровня экпрес-сии BDNF (нейротрофический фактор мозга) в этих клетках [8]. На основании этих данных была выдвинута гипотеза, согласно которой действие меланокортинов может осуществляться через ре-
Институт молекулярной генетики Российской Академии наук, Москва
гуляцию уровня экспрессии ряда известных нейротрофических факторов, таких как NGF, BDNF, нейротрофинов-3, -4/5 и др. [7, 8]. Эксперименты, проведенные на животных, показали, что меланокортины способны ускорять регенерацию аксонов после повреждения периферических нервных волокон и стимулировать прорастание отростков нейронов в центральной нервной системе [4].
Плюрипотентные стволовые клетки как эмбрионального происхождения, так и генетически репрограммированные широко используются в качестве экспериментальной модели для изучения ранних стадий дифференцировки эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в клетки тканей разных зародышевых листков [9]. На ЭСК изучали влияние пептидов РАСАР (гипофизарный полипептид, активирующий аденилатциклазу) и VIP (вазоактивный пептид кишечника). Оба пептида являются нейротрофическими факторами при эмбриогенезе мозга. РАСАР на уровне белка и мРНК экспрессируется в эмбрионах крысы и в нервной трубке у мышей. VIP аналогично был определен в мозгу эмбрионов мыши. Присутствие этих нейропептидов и их рецепторов в эмбриональном мозгу говорит об их роли на первых этапах развития мозга. Введение РАСАР и VIP в ЭСК на стадии образования эмбриоидных тел (ЭТ) приводило к стимуляции нейрональной дифференцировки [10].
В настоящее время описано пять типов рецепторов меланокортинов - МСЯ1, MCR2, MCR3, MCR4, MCR5. Альфа-МСГ обладает высокой аффинностью ко всем видам МСR, кроме рецепторов второго типа, которые более селективны к АКТГ. Все перечисленные формы MCR функционально связаны с аденилатциклазой и осуществляют свое действие, в первую очередь, через активацию цАМФ-зависимого сигнального пути [11].
Целью настоящей работы явилось изучение влияния альфа-МСГ на начальные стадии дифференцировки ЭСК мыши.
110 МАНУИЛОВА и др.
Таблица 1. Структура праймеров, использованных в работе
№ Название гена Структура праймеров T °C J отжига' ^ Кол-во циклов
1 GAPDH 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'-s 5'-GACCACAGTCCATGCCATCACT-3'-as 60 30
2 MCR3 5'-CGATGCTGCCTAACCTCTCTG-3'-s 5'-AACTGGTCCTCCAAGGTCAGG-3'-as 60 38
3 MCR4 5'-ATGTTCCTGATGGCGAGGC-3's 5'-CATGAAGCACACGCAGTATGG-3'-as 60 38
4 MCR5 5'-CGGACGAGAGCAGAATGGTAA-3'-s 5'-CGATGTGTCGCACAAAGGTG-3'-as 60 38
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Культивирование ЭСК мыши. В работе использовали ЭСК мышей линии R1, любезно предоставленные доктором A. Nagy ( Mount Sinai Hospital, Торонто, Канада). Методика культивирования ЭСК подробно описана в статье Е.В. Новосадовой [12].
Определение пролиферативной активности ЭСК. Оценку пролиферативной активности клеток в контроле и под влиянием альфа-МСГ ("Sigma", США) проводили на третьи сутки после посева прямым подсчетом клеток под микроскопом Olympus СКХ41 ("Olympus", Япония) в камере Горяева в присутствии трипанового синего. Жизнеспособность клеток также оценивали с помощью МТТ-теста. Альфа-МСГ добавляли в ростовую среду, начиная с момента посева клеток, каждый день в течение трех суток.
Индукция дифференцировки ЭСК с образованием эмбриоидных тел (ЭТ). Для формирования ЭТ суспензию ЭСК переносили на чашку Петри (d = = 35 мм, "Nunc", Дания) из расчета 400 • 103 клеток на чашку, затем помещали в С02-инкубатор. На 2-е и 3-и сутки образовавшиеся ЭТ переносили на чашки, покрытые желатином (0.01%, "Serva", ФРГ) для дальнейшей дифференцировки [12]. Для изучения влияния альфа-МСГ на образование ЭТ пептид вводили в ростовую среду каждый день в течение 3 суток, начиная с момента посева клеток на чашки с желатиновой подложкой в среде с LIF (фактор, ингибирующий лейкемию), или на стадии образования ЭТ, т.е. при культивировании клеток без LIF.
Индукция дифференцировки ЭСК по нейро-нальному пути. Для изучения влияния альфа-МСГ на разные стадии дифференцировки ЭСК пептид вводили в культуральную среду на стадии образования ЭТ каждый день. В период процесса диф-ференцировки альфа-МСГ в разных концентрациях вводили в культуральную среду на следующий день после посева ЭТ в 4-луночные
планшеты, покрытые желатином (по 5—6 тел на лунку), и через каждые 3 дня до фиксации материала. Форсколин, который использовали в этих экспериментах в качестве положительного контроля, вводили в культуральную среду через каждые 7 дней до конечной концентрации 10-5 М. В контрольных вариантах, где наблюдается спонтанная дифференцировка ЭСК, вводили равный объем PBS (фосфатно-солевой буфер). На 17-й день от начала дифференцировки клетки фиксировали 4%-м параформальдегидом и проводили иммуноцитохимический анализ с помощью антител к тубулину бета-III ("Abcam", Великобритания, ab 7751). Подсчет тубулин-положительных клеток проводили с помощью микроскопа Olympus СКХ41 ("Olympus", Япония). Подсчет площадей нервных узлов проводили с помощью программы SigmaScan Pro 5.
Определение экспрессии генов рецепторов аль-фа-МСГ. Выделение тотальной РНК, проведение обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции проводили по методике, указанной в работе [12]. Структура праймеров, использованных в работе, приведена в табл. 1.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов проводили на основе стандартного пакета статистических программ "Statistica 7.0" для WinXP с использованием непараметрического критерия Манна—Уитни.
Первоначально с помощью ОТ-ПЦР мы исследовали экспрессию генов рецепторов альфа-МСГ: MCR3, MCR4, MCR5 в недифференцированных ЭС клетках, ЭТ и на разных стадиях диф-ференцировки ЭС клеток (7-й и 14-й день от начала дифференцировки). В качестве положительного контроля использовали мРНК, выделенную из мозга мыши. На рис. 1 видно, что гены рецепторов MCR3 и MCR4 начинали экспрессировать-
ВЛИЯНИЕ АЛЬФА-МЕЛАНОЦИТСТИМУЛИРУЮЩЕГО ГОРМОНА
111
MCR3 [200 п.н. MCR4 [300 п.н.
MCR4 [400 п.н.
GAPDH
Рис. 1. Результаты ПЦР для меланокортиновых рецепторов типа 3, 4, 5(МСК3, МСК4, МСК5).
1. Плюрипотентные ЭС клетки; 2. 3-дневные эмбриоидные тела; 3. ЭСК на 7-й день дифференцировки; 4. ЭСК на 14-й день дифференцировки; 5. Положительный контроль — тотальный мозг мыши; 6. Отрицательный контроль — смесь РНК после процедуры обратной транскрипции без добавления обратной транскриптазы; ОЛРВН — глицераль-дегид-3-фосфатдегидрогеназа (контроль ОТ-ПЦР).
ся на стадии ЭТ, и их экспрессия продолжалась в ходе дифференцировки ЭСК. Для гена рецептора MCR5 наблюдалась другая картина. Экспрессия этого гена проявлялась как в недифференцированных клетках, так и на всех исследуемых стадиях дифференцировки. Наличие экспрессии генов рецепторов меланокортинов позволило предположить, что альфа-МСГ через эти рецепторы может оказывать влияние на пролиферацию, образование ЭТ и на начальные этапы дифференци-ровки ЭСК.
При исследовании влияния альфа-МСГ на пролиферативную активность ЭСК и на способность формирования ими ЭТ данный пептид использовали в концентрации 10-9 М, которая чаще всего применяется в экспериментах в условиях in vitro и in vivo [6, 8]. Полученные результаты показали, что альфа-МСГ в концентрации 10-9 М практически не оказывает влияния как на проли-феративную активность ЭСК, так и на образование ЭТ (данные не представлены).
Далее были проведены эксперименты по изучению влияния альфа-МСГ (концентрация 10-9 М) на дифференцировку ЭСК по нейрональному пути. Введение пептида в культуральную среду в концентрации 10-9 М в период формирования ЭТ приводило к существенному увеличению (примерно в 5—6 раз) количества нейронов в опытном варианте по сравнению с контролем. Аналогичная картина наблюдалась при введении альфа-МСГ (10-9 М) в культуральную среду как в период образования ЭТ, так и в период процесса диффе-ренцировки ЭСК (табл. 2). Обращает на себя внимание тот факт, что нейрональная дифференци-ровка ЭСК в этих условиях, в двух вариантах эксперимента (введение альфа-МСГ на стадии образования ЭТ и ЭТ в период дифференциров-ки) происходила в основном по пути образования единичных нейронов (рис. 2).
На следующем этапе исследовали зависимость величины эффекта от концентрации альфа-МСГ (10-9 М, 10-12 М, 10-13 М, 10-14М) при введен
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.