МИКРОБИОЛОГИЯ, 2010, том 79, № 3, с. 314-320
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 616-097;579.017.7
ВЛИЯНИЕ АЛКИЛОКСИБЕНЗОЛОВ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ И ОПЕРАЦИОННУЮ СТАБИЛЬНОСТЬ АНТИТЕЛ © 2010 г. Д. Г. Дерябин*1, Н. А. Романенко*, Г. И. Эль-Регистан**
*Оренбургский государственный университет **Учреждение Российской академии наук Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва Поступила в редакцию 26.05.2009 г.
Обнаружено влияние различающихся гидрофобностью гомологов алкилоксибензолов (АОБ) на сохранение способности антител к взаимодействию с соответствующими антигенами при денатурирующих воздействиях (функциональная стабильность) и неоптимальных условиях проведения реакции (операционная стабильность). Установлено, что АОБ влияют на чувствительность антител к термоденатурации и УФ-облучению и разнонаправленно изменяют диапазон активности при различных значениях рН. Выявлена зависимость регистрируемых эффектов от особенностей химического строения и использованных концентраций АОБ. Обсуждаются механизмы подобного действия алкилоксибензолов и возможные перспективы их использования в качестве стабилизаторов антител.
Ключевые слова: антитела, алкилоксибензолы, алкилрезорцины, функциональная и операционная стабильность, стабилизаторы антител.
Алкилоксибензолы (АОБ) микробного и растительного происхождения демонстрируют чрезвычайно широкий спектр биологических активностей, что делает их объектом большого числа междисциплинарных исследований [1, 2]. Функции алкилоксибен-золов класса алкилрезорцинов как реакционноспо-собных соединений подробно рассмотрены в работах польских исследователей, сосредоточивших свое внимание на растительных алкилрезорцинах [1]. В микробиологии изначально интерес к этой группе веществ определялся их важной ролью в модификации структуры мембран при развитии у бактерий гипоме-таболического и анабиотического состояния, сопровождающего образование покоящихся форм [2, 3], в том числе при формировании цист Azotobacter vinelan-dii [4], а также цистоподобных покоящихся клеток (ЦПК) неспорообразующих бактерий [2]. В настоящее время внимание исследователей привлечено к изучению функции АОБ в стрессовом ответе бактерий и грибов [5]. Алкилоксибензолы рассматриваются в качестве универсальных природных модификаторов с функциями адаптогенов, реализующих свою активность в отношении биологических объектов разного уровня организации [2, 6]. В свою очередь условием для этого является свойственная АОБ способность к образованию ряда слабых гидрофобных и электростатических взаимодействий и межмолекулярных водородных связей с компонентами клеточных мембран [7], протеинами [8] и нуклеиновыми кислотами [9], что приводит к изменению структурной организации
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: dgderyabin@yandex.ru).
и вследствие этого — функциональной активности и стабильности клеточных биополимеров и надмолекулярных структур.
В наших предыдущих исследованиях [10, 11] охарактеризованы эффекты, производимые при взаимодействии АОБ с ферментными и иммунными белками человека и животных, показана выраженная модуляция функциональной активности белков, сопровождающаяся частичным изменением их субстратной и антигенной специфичности. На примере лизоцима яичного белка показано стабилизирующее действие двух гомологов АОБ, которое определялось как сохранение более высокого уровня каталитической активности модифицированного фермента после денатурирующего воздействия — термической обработки (функциональная стабильность) или при неоптимальных температурах катализа (операционная стабильность) [10].
Целью настоящей работы стало изучение эффектов химических аналогов микробных АОБ: влияния на функциональную и операционную стабильность антител, оцениваемую по способности их связывания с соответствующими антигенами после термической денатурации, воздействия УФ-излучения, а также при неоптимальных значениях рН.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве химических аналогов микробных ал-килоксибензолов использовали гомологи со степенью очистки 99.9%, различающиеся длиной ал-
кильного радикала и определяемой этим степенью гидрофобности: С7-АОБ (М = 124) и С12-АОБ (М = = 194) ("Sigma", США), а также С9-АОБ (М = 152) и С18-АОБ (М = 278) ("Enamine", Украина). Для модификации антител применяли водные (в случае С18-АОБ спиртовые) растворы этих веществ в концентрациях 10-5 М, 10-4 М и 10-3 М.
Оценку влияния АОБ на функциональную и операционную стабильность антител оценивали по способности их связывания с соответствующими антигенами. В исследованиях использовали наборы "ВектоТоксо-IgG" ("Вектор-Бест", Новосибирск, Россия) для иммуноферментного количественного определения иммуноглобулинов класса G к Toxoplasma gondii. В качестве источника антител использовали имеющиеся в наборах контрольные образцы с активностью, равной 80 международным единицам (МЕ) в 1 мл.
Количественное связывание антител с соответствующими антигенами оценивали методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием комплекта лабораторного оборудования "Униплан" и "Проплан" (ЗАО "Пикон", Россия).
Для модификации структуры белка перед проведением экспериментов антитела смешивали с раствором АОБ в соотношении 1 : 1 и инкубировали при 37°С в течение 60 мин. В контрольных вариантах вместо раствора АОБ вносили эквивалентное количество растворителя (для С18-АОБ — 5% этанола).
Функциональную термостабильность антител определяли по сохранению остаточной активности образцов после их прогревания в течение 15 мин в твердотельном термостате "Термит" ("ДНК-Технология", Россия) в диапазоне температур от 50 до 80°С с дискретностью в 3°С. Оценку термоинактивации комплексов "антитела : АОБ" проводили с использованием величин ET20 и ET50, соответствующих снижению показателей связывания антител с соответствующими антигенами, сорбированными в лунках полистироловых планшетов, на 20 и 50% от исходных значений.
Функциональную стабильность интактных и модифицированных АОБ антител при ультрафиолетовом облучении оценивали после освещения белковых растворов широкополосной УФ-лампой ("Osram", Германия). При этом оцененная с использованием УФ-радиометра "ТКА-ПКМ" (Россия) энергетическая освещенность образцов в диапазоне длин волн 200—280 нм составила 24.85 Вт/м2, а время экспозиции варьировало от 0 до 120 мин с дискретностью 20 мин. В качестве интегрального параметра, характеризующего чувствительность антител к этим воздействиям, использован показатель ID50 — доза УФ-излучения (Дж), приводящая к подавлению связывания антител с соответствующими антигенами на 50% от исходного.
При исследовании операционной стабильности антител при различных значениях рН их растворы в равных объемах смешивали с фосфатным буфером с соответствующим рН. Значения нормируемого параметра в буфере составляли от 3 до 11 ед с интервалом в 1 ед, что определяли с использованием анализатора жидкости "Эксперт-001" ("Эко-никс-Эксперт", Россия). Полученные смеси вносили в лунки планшетов с сорбированными антигенами, инкубировали в течение 15 мин, после чего оценивали интенсивность связывания с использованием традиционной технологии иммунофер-ментного анализа. Результат реакции оценивали соотношением значений связывания для модифицированных АОБ и интактных антител при каждом установленном значении рН.
Все эксперименты выполнены минимум в пяти повторностях. Статистическая обработка полученных результатов проведена с использованием пакета программ "81а1А5Иса".
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Определение функциональной термостабильности специфичных к T. gondii антител (натив-ных, без АОБ) по показателям их связывания с соответствующими антигенами, сорбированными в лунках полистироловых планшетов, позволило зафиксировать характерную S-образную зависимость результативного параметра от интенсивности температурного воздействия [12]. При этом наибольшее относительное снижение показателей связывания регистрировалось в диапазоне от 59 до 71°С, а величины ET20 и ET50 были отмечены при температурах 61.5 ± 0.5°С и 65.9 ± 0.4°С соответственно (рис. 1).
В опытных вариантах предварительная модификация антител алкилоксилбензолами приводила к изменению уровня терморезистентности белков в зависимости как от структуры используемого гомолога АОБ, так и от концентраций взаимодействующих компонентов. Так, С7-АОБ в контрольных вариантах (без температурного воздействия) не оказывал выраженного влияния на связывание модифицированных им антител с соответствующими антигенами. В опытных вариантах после прогревания модифицированных С7-АОБ антител в диапазоне температур от 50 до 65°С наблюдалась значительная дисперсия результативных параметров (рис. 1а). Одним из следствий модификации стало повышение значения ET20 от 61.5 ± 0.5 до 62.9 ± 0.3°С (P < 0.05) для комплекса антител с С7-АОБ в концентрации 10-5 М и его снижение до 52.3 ± 0.4°С (P< 0.001) при использовании С7-АОБ в концентрации 10-4 М. Достоверное влияние модификации антител на параметр ET50 отсутствовало.
ОП
120
100
80
60
40
20
%
0
ОП, %
120
100^
50 55 60 65 70
75 80
T, °C
80
60
40
20
0
50 55 60 65 70
75 80
T, °C
Рис. 1. Показатели связывания антител к Toxoplasma gondii и их комплексов с С7-АОБ (а) и С12-АОБ (б) после температурного воздействия: по оси абсцисс — температура, °С, по оси ординат — относительные величины связывания антител с соответствующими антигенами, %. Обозначения: 1 — контроль (без АОБ); 2 — в комплексе с АОБ в концентрации 10-5 М, 3 - 10-4 М, 4 - 10-3 М.
Модификация антител другим гомологом С12-АОБ, существенно более гидрофобным, изначально вела к выраженному дозозависимому снижению их функциональной активности. Это может объясняться структурной модификацией белка вследствие взаимодействий алкильных радикалов С12-АОБ с гидрофобными участками в активной анти-генсвязывающей области молекулы белка с соответствующим изменением его аффинности, авид-ности и специфичности, что было показано ранее [11]. В опытных вариантах проведение термообработки модифицированных антител вело к еще большему подавлению показателей связывания (рис. 1б), что хорошо илл
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.