ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 4, с. 488-496
УДК 581.14.21+576.311.347
ВЛИЯНИЕ АМБИОЛА НА УЛЬТРАСТРУКТУРУ МИТОХОНДРИЙ В КЛЕТКАХ АПЕКСОВ КЛУБНЕЙ ИСХОДНЫХ И ТРАНСГЕННЫХ
РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ
© 2004 г. Т. А. Платонова, А. С. Евсшнина, Н. П. Кораблева
Институт биохимии им. АН. Баха РАН, Москва, 119071; e-mail: Platonova@inbi.ras.ru Поступила в редакцию 18.10.2003 г.
Проведено сравнительное ультраструктурное и морфометрическое изучение митохондриального аппарата клеток апексов клубней исходного и трансформированного по гену дефензина (трансгенного) картофеля в норме и под действием регулятора роста амбиола. Не обнаружено качественных и количественных различий между митохондриями клеток исходных и трансгенных растений картофеля в контроле. Под действием амбиола отмечены лишь количественные различия в числе и объеме митохондрий между клетками исходных и трансгенных форм, что может быть связано как с физиолого-биохимическими изменениями в трансгенных растениях, вызванными экспрессией гена дефензина (гормональный баланс, функциональная активность цитоплазматической мембраны и др.), так и с влиянием амбиола на эти параметры.
В последние годы все большее внимание исследователей уделяется поиску и синтезу биологически активных веществ (БАВ), повышающих устойчивость растений к различным стрессовым воздействиям. К числу таких веществ относятся и синтетические регуляторы роста, способные в зависимости от концентрации стимулировать или ингибировать ростовые процессы у растений и, в частности, у таких важнейших сельскохозяйственных культур как картофель (Solanum tuberosum L.), повышая при этом его устойчивость к микроорганизмам и другим неблагоприятным факторам [1]. В этой связи, заслуживающим внимание представляется новый, еще сравнительно мало изученный синтетический регулятор роста - антиоксидант ам-биол (дигидрохлорид 2-метил-4-диметиламиноме-тил-5-гидроксибензимидазол), впервые синтезированный в Институте биохимической физики РАН и обладающий антистрессовыми свойствами [2-7]. В настоящее время получены данные о действии амбиола на формообразовательные процессы, рост и развитие растений [8-12], на содержание фитогормонов в тканях растений картофеля и на активность плазмалемной Н+-АТФазы в клетках клубня картофеля [3, 13-16]. Следует при этом отметить, что исследования по изучению ультраструктурных аспектов действия амбиола на растительный организм отсутствуют.
В качестве модели для изучения механизма действия амбиола на растительный объект особый интерес представляют генетически трансформированные (трансгенные) растения, в частности, растения картофеля, несущие ген антимикробных олигопептидов или так называемых
дефензинов. Установлено, что дефензины обладают защитными свойствами против фитопатоге-нов [3, 17], что имеет большое значение для повышения устойчивости и продуктивности растений картофеля.
Для изучения механизма действия антистрессовых антиоксидантов, в частности, амбиола на растительный организм мы попытались в настоящей работе выяснить, как влияет этот препарат на внутриклеточные реакции в тканях апикальных меристем исходных и трансгенных клубней картофеля на начальных этапах прорастания. Ранее, при изучении ультраструктурных аспектов действия синтетических регуляторов роста -брассиностероидов (БР) на клетки апексов клубней картофеля нами было показано, что зона стержневой меристемы играет ведущую роль на начальных стадиях прорастания апикальных меристем, и ее клетки являются клетками-мишенями для рост-регулирующего действия БР [18, 19]. В связи с этим для нас представляли особый интерес клетки стержневой меристемы, а именно, состояние их митохондриального аппарата. Мито-ходрии - одна из наиболее удобных для анализа структур при изучении реакции клеток на действие БАВ, поскольку их тонкая структура в значительной степени является показателем функционального состояния клеток.
Представляемая работа является продолжением исследований по изучению механизма действия амбиола на исходные и трансформированные по гену дефензина (трансгенные) растения картофеля сорта Дезире [3, 10, 11, 13, 14, 16].
Изменение числа и объема митохондрий в клетках стержневой меристемы клубней исходных и трансгенных растений картофеля под влиянием амбиола
Исходные Трансгенные
Параметр концентрация амбиола, мг/л
0 5 60 0 5 60
Число на срезе, шт. Общий объем, усл. ед.* Объем 1 митохондрии, усл. ед.* 4.8 ± 0.6 15.1 ± 1.6 3.4 ± 1.0 3.1 ± 0.2 12.7 ± 0.8 4.4 ± 0.2 3.5 ± 0.3 7.9 ± 0.9 2.3 ± 0.6 5.8 ± 0.4 14.9 ± 1.0 2.5 ± 0.1 2.5 ± 0.2 8.8 ± 0.7 3.8 ± 0.3 6.9 ± 0.4 19.8 ± 1.7 2.8 ± 0.1
* Усл. ед. - морфометрические показатели (а ± £), где а - среднеарифметическая величина, £ - стандартная ошибка.
Цель работы - изучение ультраструктуры митохондрий в клетках стержневой меристемы апексов клубней исходного и трансгенного картофеля в норме и под действием рост-регулирую-щих концентраций амбиола.
МЕТОДИКА
Объект исследования - апексы клубней исходных и трансгенных растений картофеля Solanum tuberosum L. сорта Дезире на стадии прорастания после вынужденного покоя. Трансформация растений картофеля была проведена во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии РАСХНИЛ [3]. Авторы выражают благодарность д.б.н. В.В. Мазину за предоставленные клубни исходного и трансгенного картофеля.
Целые клубни исходных и трансгенных растений, находящиеся в состоянии покоя, замачивали на 20 ч в растворе амбиола. Для опыта использовали рост-регулирующие (5 и 60 мг/л) концентрации амбиола [3]. Контролем служили исходные и трансгенные клубни картофеля, замоченные в дистиллированной воде.
Через 2 мес. хранения в темноте при температуре +4°C (при наличии на контрольных клубнях признаков прорастания) под бинокулярным микроскопом МБС-2 ("ЛОМО", Россия) во всех вариантах опыта препарировали апексы клубней, фиксировали их в 2.5%-ном глутаровом альдегиде на 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.1-7.2), до-фиксировали в 1%-ном OsO4, обезвоживали в серии этанола возрастающей концентрации и ацетоне, заключали в эпоксидную смолу Эпон-812 по общепринятой методике [20]. Для сравнительного изучения были взяты клетки стержневой меристемы апексов из контрольных и опытных вариантов. Предварительную ориентировку срезов для определения зональности апексов выполняли под световым микроскопом, используя полутонкие срезы. Ультратонкие срезы, полученные на ультрамикротоме LKB-3 ("LKB", Швеция) контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца
[21] и просматривали под электронными микро-скопоми ШМ-7А и ШМ-100С ("1ео1", Япония). Для количественной оценки митохондриального аппарата пользовались методом ультраструктурной морфометрии [22], применяемым нами в наших предыдущих исследованиях [18, 19, 23]. В настоящей работе мы измеряли число митохондрий на срезе клетки и их общий объем. Для подсчета отбирали по 25-30 электронно-мироскопических изображений клеток стержневой меристемы с конечным увеличением 30000. Для измерения объема популяции митохондрий в клетке использовали морфометрическую сетку с шагом в 1 см, которую накладывали на изображение клетки и подсчитывали число точек Р (то есть узлов пересечения линий сетки), попавших на изображение митоходрий в клетке. Применение морфометри-ческой сетки позволяет заменить измерение площадей (Б2) и объемов (У3) структур подсчетом числа точек (Р), заключенных внутри контура структуры или суммы одноименных структур в клетке. Согласно правилам стереологии Б2 и Р в двухмерном изображении (в плоскости электронно-микроскопической фотографии), согласно правилам стереологии, пропорциональны объемам структур в трехмерном пространстве (У3), то есть, У3 ~ Б2 ~ Р [22]. Таким образом мы характеризовали объемы митохондрий в морфометрических (условных) единицах. Число митохондрий подсчитывали визуально на тех же изображениях клеток. Все сравнения проводили в пределах соответствующих условных морфометрических единиц. Результаты измерений, выраженные средними морфометри-ческими показателями и их стандартными ошибками, представлены в таблице. Статистическая обработка данных (с 68%-ным уровнем доверительности) проведена на основе общепринятых формул [24].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В клетках стержневой меристемы апексов клубней исходных растений картофеля митохондрии были достаточно разнообразными по морфологии даже в пределах одной клетки. Они были округлой
Рис. 1. Разнообразие морфологии митохондрий в клетках апексов исходных растений картофеля (контроль): а - многочисленные митохондрии в цитоплазме клеток; б, в - митохондрии с участками малой электронной плотности в центре и слабо выраженными кристами; г - удлиненная митохондрия с неупорядочно ориентированными кристами; д -делящаяся митохондрия.
Обозначения к рис. 1-6: Ам - амилопласт; В - вакуоль; ВО - вырост оболочки; ИГ - интрамитоходриальная гранула; КС - клеточная стенка; ЛК - липидная капля; М - митохондрия; Мд - митохондрия делящаяся; Ми - митохондрия с инвагинацией; П - пластида; Р - рибосомы; Ц - цитоплазма, Я - ядро.
или слегка вытянутой формы (рис. 1а, г); имели среднюю электронную плотность матрикса, равную либо незначительно превышающую плотность окружающей гиалоплазмы (рис. 1а-г). У отдельных митохондрий в центре обнаруживались участки малой электронной плотности (рис. 16, в). Митохондрии имели неупорядочно ориентированные, рыхло расположенные кристы (рис. 1в, г), часто слабо выраженные (рис. 1в). В матриксе отдельных митохондрий можно было наблюдать темные интрамитохондриальные гранулы неизвестной природы. Встречались мито-
хондрии с перетяжками (рис. 1д), что может служить признаком деления митохондрий.
В клетках контрольных трансгенных растений внутренняя структура митохондрий не отличалась от вышеописанной у исходных растений (рис. 2а-г), они также были разнообразны по морфологии, иногда встречались митохондрии с инвагинациями, содержащими внутри небольшие участки цитоплазмы (рис. 26). Не наблюдалось заметных отличий в числе и объеме митохондрий между клетками исходных и трансгенных форм (таблица).
Рис. 2. Разнообразие
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.