БИОХИМИЯ, 2012, том 77, вып. 1, с. 90 - 98
УДК 577.34
ВЛИЯНИЕ АМИНОКИСЛОТНЫХ ЗАМЕН К223Е и К226Е В БЕЛКЕ PsbO ФОТОСИСТЕМЫ 2 НА СТАБИЛЬНОСТЬ И ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ВОДООКИСЛЯЮЩЕГО КОМПЛЕКСА В КЛЕТКАХ СЫашуйошопаБ ггткагйШ
© 2012 г. А.В. Пиголев*, Д.С. Тимошевский, В.В. Климов
Институт фундаментальных проблем биологии РАН, 142290 г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 2; факс: (496)733-0532, электронная почта: alexey-pigolev@rambler.ru
Поступила в редакцию 23.05.11 После доработки 21.07.11
С помощью сайтнаправленного мутагенеза исследована роль остатков 1^223 и 1^226 (ЬвАКРРК) в функциональной активности белка РвЪО фотосистемы 2 в клетках Chlamydomonas тикаМи. Гомологичные остаткам Шв228 и Шв231 цианобактерий, 1^223 и 1^226 находятся на обращенной в люмен стороне белка и могут участвовать в формировании канала, соединяющего Мп-кластер с внутритилакоидным пространством. На основе клеток штамма АрзЬО были созданы мутанты водорослей с заменой лизина на глутамино-вую кислоту — К223Е и К226Е. Обнаружено, что смена заряда в результате мутации К226Е приводит к нарушению стабильности белка и развитию АрзЬО-фенотипа (отсутствие фотоавтотрофного роста и фотосинтетической активности фотосистемы 2) с пониженным содержанием белка в клетке. В случае с К223Е содержание РвЪО в клетках снижено не было и клетки мутанта К223Е были способны к фотоавтотрофному росту и фотосинтетическому выделению кислорода. Однако по сравнению с контролем скорость выделения кислорода и отношение Fv/Fm были снижены на 15—20%. Также было увеличено время темновой релаксации переменной флуоресценции в присутствии диурона, что может свидетельствовать о нарушении функционирования водоокисляющего комплекса. Показана значимость для активности водоокисляющего комплекса аминокислотных остатков К223 и К226, расположенных на люменальной поверхности белка РвЪО.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: белок РвЪО, сайтнаправленный мутагенез, фотосистема 2, водоокисляющий комплекс, Chlamydomonas reinhardtii.
Марганецстабилизирующий белок (МСБ) — обязательный компонент водоокисляющего комплекса (ВОК) всех оксигенных фотосинте-зирующих организмов [1, 2], хотя его роль в процессе окисления воды остается невыясненной. Вместе с другими внешними белками водо-окисляющего комплекса МСБ необходим для стабилизации неорганического ядра ВОК и обеспечения оптимальных скоростей выделения кислорода. Удаление МСБ из препаратов фотосистемы 2 (ФС-2) снижает скорость выде-
Принятые сокращения: ФС-2 — фотосистема 2; МСБ — марганец-стабилизирующий белок (РвЪО); ВОК — водоокисляющий комплекс; РЦ — реакционный центр; ЭТЦ — электрон-транспортная цепь; ДХБХ — 2,6-дихлор-р-бензохинон; Fv/Fm — отношение переменной флуоресценции хлорофилла к максимальному уровню флуоресценции ^¡д); ПЦР — полимеразная цепная реакция; п.о. — пара оснований.
* Адресат для корреспонденции.
ления кислорода и приводит к постепенному выходу в среду двух из четырех атомов марганца, входящих в состав ВОК [3, 4]. Однако способность ФС-2 к выделению кислорода можно сохранить (~25%), если повысить в среде измерения концентрации Cl- и Ca2+ [4, 5]. Генетические исследования показали, что инактивация МСБ in vivo приводит к развитию фенотипа, зависящего от эволюционного положения организма. Инактивация гена, кодирующего МСБ у высших растений и водорослей, ведет к потере комплекса ФС-2 и отсутствию роста в фотоав-тотрофных условиях [6, 7]. В отличие от эука-риотических организмов цианобактерии способны формировать ФС-2 и даже окислять воду в отсутствие МСБ. Так, мутант ÁpsbO Synechocys-tis sp. PCC 6803 способен расти фотоавтотроф-но, хотя кислородвыделяющая активность ФС-2 нестабильна и снижена по сравнению с таковой в клетках дикого типа и для ее проявления обя-
зательно присутствие другого внешнего белка ВОК — цитохрома с550 (РвЪУ), которого нет в составе ВОК у высших растений и зеленых водорослей [8]. У ЛряЮ-мутанта цианобактерий формируется ФС-2, способная к окислению воды, хотя для поддержания ее активности требуется повышенное содержание С1-, Са2+ или высокое значение рН среды (10,0) [8, 9]. Это позволяет предположить, что состояние Мп-кластера в отсутствие МСБ будет зависеть от состава среды, в которой он находится. Функция белка в стабилизации Мп4Са-кластера, таким образом, может заключаться в регуляции взаимодействия ВОК со средой люменального пространства хлоропластов.
Марганецстабилизирующий белок располагается на донорной стороне ФС-2 таким образом, что закрывает неорганическое ядро ВОК и ограничивает его от внутритилакоидного пространства [10]. Из-за своего положения он может регулировать доступ кофакторов, например,
хлора, кальция, бикарбоната к ВОК и обеспечивать их удержание рядом с Мп-кластером. Кроме того, МСБ может участвовать в отведении протонов из зоны реакции, формируя канал для удаления Н+. Было предположено, что в состав протонного канала могут входить следующие аминокислотные остатки: D61, Е65 и Е312, К317 белков D1 и D2 (которые входят в состав «коро-вого» комплекса ФС-2) и D158, D222, D223, D224, Н228, Е229 белка Р8ЪО [11].
Анализ структуры Р8ЪО позволяет выделить один из участков белка, который может формировать гидрофильный канал, соединяющий люмен и ВОК (рис. 1). Предполагаемый канал находится во «впадине», образуемой складкой между двумя доменами белка, и состоит из консервативных участков последовательности Р8ЪО. На стороне, выходящей к Мп-кластеру, канал сформирован последовательностью R152—R162. На другой стороне, обращенной к люмену, в его формировании может принимать участие петля
Мп-кластср
Рис. 1. Пространственная организация белка PsbO в комплексе ФС-2 (файл 3BZ1.pdb из Protein Data Bank). Штриховой стрелкой обозначен предполагаемый путь транспорта протонов от МщСа-кластера в люменальное пространство тилако-ида [11, 15]. Остатки His228 и His231, расположенные ближе к люмену, подчеркнуты
SDDDMGAHEPH (для цианобактерии Thermo-synechococcus elongatus), расположенная между в 13- и р14-слоями. Наиболее близко к Mn-клас-теру расположены остатки R152(151) и R162(161), которые, как показано, регулируют потребность ВОК в Cl— [12]. Однако замены этих аминокислот влияют на связывание PsbO с ФС-2 [12, 13]. Проводя такие замены in vivo, к примеру, в Chlamydomonas reinhardtii, можно ожидать полной деградации всего ВОК, что исключает возможность определения функциональной роли этих аминокислот. Поэтому более подходящими кандидатами для сайтнаправленного мутагенеза являются аминокислоты с другой стороны канала, обращенной в люмен, например остатки Lys223 и Lys226. У цианобактерий это остатки His228 и His231, но сравнение С-концевых последовательностей МСБ (рис. 2) показывает, что у высших растений и водорослей они консервативно замещены лизинами. Кроме того, только Lys223 и Lys226 — заряженные аминокислоты в той части петли, которая граничит с люменом — LGAKPPK. Положение этих аминокислот таково, что они располагаются между сайтом связывания белка PsbP (одна из функций которого заключается в удержании Cl— для сохранения активности ВОК) и остатками R152 и R162 белка PsbO, вероятными кандидатами на связывание Cl— вблизи Mn-кластера [13, 14]. Остатки D222 и D224 белка PsbO, расположенные на другой стороне петли Р13—Р14 (SDDDMGAHEPH), могут участвовать в формировании гидрофильного канала, но не могут связывать отрицательно заряженные ионы хлора или бикарбоната из-за заряда аспарагиновой кислоты. Следует отметить высокую консервативность этих двух остатков
лизина (несмотря на то, что они входят в состав петли — наиболее вариабельного элемента структуры белка).
Недавние исследования структуры ФС-2 показывают, что His231 цианобактерий, гомологичный К226 C. reinhardtii, может быть одним из лигандов второго атома Ca, обнаруженного в ФС-2, но не участвующего в реакции окисления воды [10, 15]. На основании рентгеноструктур-ного анализа для другого остатка His228 (K223) было предположено, что он может участвовать во взаимодействии с белком D2 с помощью водородной связи [11].
Изучение функции белка PsbO in vivo ограничивается тем, что ФС-2 в клетках мутантов становится чувствительной к фотоинактивации. Небольшие повреждения в ФС-2 могут со временем накапливаться, сильно искажая первоначальный эффект мутации. У высших растений это может приводить к потере комплекса ФС-2. Если же использовать в качестве модели клетки цианобактерий, необходимо также учитывать, что для активности ВОК у прокариотических организмов важное значение имеет белок PsbV, вследствие чего у прокариот (в отличие от высших растений и водорослей) инактивация PsbO не приводит к прекращению выделения кислорода. При определенных условиях в клетках ApsbO-штамма цианобактерий скорость выделения О2 может составлять >50% таковой у клеток дикого типа и полностью подавить выделение кислорода можно только в случае двойной мутации: ApsbO:ApsbV. Поэтому в качестве модели для сайтнаправленного мутагенеза PsbO мы использовали клетки C. reinhardtii. Зеленая водоросль C. reinhardtii является эукариотом и может
I
Пиано-бактерии
Водоросли
Высшие растения
Т. elongatus
S. elongatus A. variabilis С. reinhardtii V. carteri E. gracilis S. moellendorffii S. tuberosum P. sativum S. olejracea
200 VAKVDGRTGE VAKVDGRTGE IAKVDSSSGE VAKVDPVTCE VAKVNTATGE VAKVNAETGE VAESNTATGE VTKSNPQTGE VTQTKPETGE VTSSKFETGE
----I----I
210 IAGTFESEQL IAGTFESEQL IAGTFESEQP IAGVFESIQP IAGVFESIQP IAGVFESIQP IAGVFESIQP VIGVFESIQP VIGVFESIQP VIGVFQSLQP
I
220 SDDDMÍ SDDDMGA^EP
sdtdlgaÍep SDTDLGAjjjPP SDTDLGAyPP SDTDLGAgVP SDTDLGSgAP SDTDLGAgTP SDTDLGAgAP sdtdlgaSvp ** * . ± . I -
I — ] — I — I... 230 2-30
P gEVKIQGVFY ASIEPA- 246
¡VKIQGVFY ASIEPA- 246
VKIRGIFY ARVE------250
IKVEGLWY AQLK------239
IKITGLWY GQLSQ-- 240
IKTSGVWY AQISPSK 245
:VKIQGIWC AQLD------244
iVKIQGIWY AQLES— 240
iVKIQGVWY AQLES— 240
IVKIEGVWY AQLEQQ- 247
ß 12
I 13
! 14
Рис. 2. Сравнение аминокислотных последовательностей С-концевой области белка PsbO из разных видов цианобактерий, водорослей и высших растений. Темным цветом выделены аминокислотные остатки лизина в положениях 223 и 226 у C. rein
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.