ПОЧВОВЕДЕНИЕ, 2014, № 9, с. 1102-1106
БИОЛОГИЯ ^^^^^^^^^^^^^^^^ ПОЧВ
УДК 631.463
ВЛИЯНИЕ АНТАГОНИСТИЧНОГО ШТАММА BACILLUS SUBTILIS 26Д НА ЧИСЛЕННОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ ПОЧВЫ, ПРИЛЕГАЮЩЕЙ
К СЕМЕНАМ ПШЕНИЦЫ
© 2014 г. З. М. Курамшина1, Р. М. Хайруллин2, М. А. Лукьянцев3
1Стерлитамакский филиал Башкирского государственного университета, 453109, Стерлитамак, пр. Ленина, 49 2Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, 450054, Уфа, пр. Октября, 71 3Башкирский государственный аграрный университет, 450001, Уфа, ул. 50-летия Октября, 34
е-mail: kuramshina_zilya@.mail.ru Поступила в редакцию 11.04.2013 г.
Исследовано влияние клеток эндофитного штамма Bacillus subtilis 26Д (основа биофунгицида фито-спорин-М, антагонист многих фитопатогенных грибов) на численность бактерий и микромицетов почвы, контактирующей с поверхностью семян пшеницы. Предпосевная инокуляция семян этим штаммом уменьшала численность их эпифитной микрофлоры, а также аборигенных микроорганизмов почвы. Внесение штамма-антагониста непосредственно в почву или с семенами оказывало практически одинаковое воздействие на почвенные микроорганизмы. На плотной агаризованной среде клетки B. subtilis 26Д не проявляли антагонизма к азотфиксирующим бактериям Azotobacter vinelandii ИБ-1. Однако при обработке семян пшеницы указанным штаммом численность клеток азотфиксатора в непосредственно прилегающей к семенам почве уменьшалась по сравнению с контролем в 2.5—3.2 раза. Показано, что для оценки взаимоотношений микроорганизмов почвы и бактерий-антагонистов следует принимать во внимание результаты их взаимодействия не только на синтетических средах, но и в естественных почвенных субстратах.
Ключевые слова: бактерии Bacillus subtilis 26Д, эпифитная микрофлора семян пшеницы, почвенные микромицеты, Azotobacter vinelandii.
DOI: 10.7868/S0032180X14070089
ВВЕДЕНИЕ
Функциональное состояние микробного сообщества почвы зависит от агротехнических приемов возделывания сельскохозяйственных культур, применения удобрений и средств защиты растений [2, 4]. В настоящее время в качестве альтернативы химическим средствам борьбы с фито-патогенами стали широко применять биопрепараты на основе живых клеток бактерий, грибов и актиномицетов, так как считается, что такие биофунгициды не нарушают экологического равновесия в почве, не загрязняют окружающую среду и могут быть высокоэффективными в борьбе с болезнями растений [12]. Среди антагонистов фитопатогенов привлекают внимание представители Bacillus subtilis, благодаря их способности продуцировать различные биологически активные вещества, в том числе антибиотики и ферменты, способные подавлять рост фитопатоген-ных грибов и бактерий [18]. Важна и их преимущественная безопасность для человека и животных [5]. Однако многие биологические свойства таких бактерий-антагонистов остаются
до конца не изученными, в том числе особенности их взаимоотношений не только с фитопато-генными, но и с "хозяйственно полезными" микроорганизмами почвы. Так, при инокуляции посевного материала растений антагонистическими штаммами B. subtilis отмечено подавление роста фитопатогенов на поверхности семян и в почве. Отмечено, что антагонисты (при отсутствии высокой селективности к видовому составу объектов-мишеней) могут подавлять развитие и полезной микрофлоры, например, микромицетов рода Trichoderma, азотфиксаторов Rhizobium, Azotobacter и других, оказывая, тем самым, влияние на их разнообразие, численность и активность. Вместе с тем, антибиотическая активность бактерий-антагонистов может зависеть от состава среды культивирования микроорганизмов, а также ее физического состояния (жидкая или твердая) [15]. В связи с этим активность антагонистов in vitro может отличаться от таковой, например, в естественной почвенной среде.
Целью работы было изучение влияния инокуляции семян пшеницы эндофитным штаммом-
ВЛИЯНИЕ АНТАГОНИСТИЧНОГО ШТАММА Bacillus subtilis 26Д
1103
антагонистом В. $иЫШ$ 26Д — основой биофунгицида фитоспорин-М (ООО НВП "БашИнком") на численность эпифитной микрофлоры семян пшеницы и микроорганизмов в почве.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования служили бактерии эн-дофитного штамма В. яиЬИШ 26Д (ВНИИСХМ № 128). Культура предоставлена сотрудниками Башкирского государственного аграрного университета (г. Уфа). В экспериментах использовали суспензию клеток суточной культуры, выращенной на качалках в жидкой полусинтетической среде [12]. Клетки бактерий отмывали центрифугированием в растворе 0.01 М КС1, затем доводили их число до необходимой концентрации методом десятичных разведений, определяя начальную концентрацию (показатель КОЕ — колониеобразующие единицы) методом титрования на мясо-пептонном агаре (МПА).
Почву (выщелоченный чернозем, навески массой 50 г) стерилизовали автоклавированием (120°С, 1.1 атм., 60 мин), которое повторяли через 24 ч. Посев семян пшеницы в стерильную почву (чашки Петри) проводили через 14 дней после второго автоклавирования.
Для оценки влияния бацилл на эпифитную микрофлору зерна нестерильные семена яровой пшеницы (ТгШеиш агзНуит Ь., сорт Омская 35) инокулировали клетками В. зиЬИШ 26Д (20 мкл суспензии, 105 или 106 кл./мл, на 1 г семян). На поверхность стерильной почвы раскладывали 10 семян пшеницы (асептические условия), засыпали стерильной почвой и увлажняли стерильной дистиллированной водой до 70% полной полевой влагоемкости (ППВ). Чашки помещали в темное место (25°С). Через 5 сут зерна с прилипшими частицами почвы вынимали (соблюдая стерильность) и отделяли ее от семян, объединяли и тщательно перемешивали. Навеску почвы (1 г) помещали в фарфоровую чашку и 5 мин растирали пестиком, добавляя 100 мл стерильной водопроводной воды. Суспензию переносили в колбы, перемешивали 10 мин на магнитной мешалке. Отбирали аликвоты почвенной суспензии и производили микробиологический посев серией 10-кратных разведений на поверхность МПА в чашках Петри. Чашки инкубировали при 25°С. На третий день определяли показатель КОЕ [11]. Опыт проводили в шестикратной повторности.
Для оценки влияния инокуляции на аборигенные почвенные микроорганизмы почвы сухие семена пшеницы (10 шт.) автоклавировали (120°С, 1.1 атм., 60 мин), затем обрабатывали клетками штамма В. зиЫШз 26Д и вносили в чашки Петри с нестерильной сухой почвой, увлажняя ее сте-
рильной водой до 70% ППВ. Далее эксперимент проводили как описано выше.
В другом опыте нестерильную почву обрабатывали суспензией спор B. subtilis 26Д (105 или 106 КОЕ/г почвы) и увлажняли стерильной дистиллированной водой. Чашки Петри выдерживали 7 сут при температуре 25°C. Через 2, 3, 4, 7 сут почву перемешивали, отбирали навеску (3 г) и производили посев десятикратных последовательных разведений почвенной суспензии на поверхность МПА. Чашки инкубировали (28°C) и через 3 сут определяли показатель КОЕ.
Для анализа антагонистической активности штамма 26Д B. subtilis к аборигенным почвенным микромицетам 10 г нестерильной почвы помещали в конические колбы (объем 100 мл), обрабатывали суспензией бактерий (104 или 106 КОЕ/г почвы) и увлажняли стерильной дистиллированной водой. Через 2—3 сут производили подсчет количества грибных пропагул в почве (метод десятикратных разведений). Для этого в колбу приливали 50 мл водного раствора Tween 80 (100 мкл/л), помещали на шейкер (5 мин), а затем готовили десятикратные разведения в растворе NaCl (0.9%). Аликвоты разведений вносили в чашки Петри, добавляли 15 мл картофельно-глюкозного агара и перемешивали до его застывания (инкубация 2 сут, 25°С).
Характер взаимоотношений клеток B. subtilis 26Д с азотофиксирующими бактериями Azoto-bacter vinelandii ИБ-1 in vitro анализировали методом перпендикулярных штрихов и агаровых блоков, а также непосредственно в почве, по методике, описанной ниже. Бактерии A. vinelandii ИБ-1 выращивали на агаризованной среде (г/л): сахароза - 10; KH2PO4 - 1.0; MgSO4 • 7H2O - 0.2; CH3COONa - 0.2; цитрат кальция - 0.2; NaCl -0.1; FeSO4 • 7H2O - 0.01; Na2MoO4 • 2H2O - 0.001; рН 7.5; агар-агар - 2%. Культуры бактерий (возраст 1 сут) высевали на питательные среды (чашки Петри), инкубировали (6 ч, 25°С), а затем вырезали блоки из сред (пробковым сверлом), которые помещали на среды с культурами тест-объекта (инкубация 2 сут, 25°С). Учитывали площадь зоны подавления роста тест-объектов исследуемыми штаммами [9].
Изучали взаимоотношения антагонистического штамма B. subtilis 26Д и азотфиксирующих бактерий A. vinelandii ИБ-1 в почве. Семена пшеницы и почву автоклавировали (как описано выше). Варианты экспериментов были следующими: 1) почва + A. vinelandii (106 КОЕ/г) + стерильные семена пшеницы, обработанные B. subtilis; 2) A. vinelandii вносили только под стерильные семена, обработанные B. subtilis; 3) почва + стерильные семена, обработанные A. vinelandii (20 мкл суспензии клеток/г семян, титр 2.5 х 106 кл./мл) и затем - B. subtilis. Чашки выдерживали в темном
Таблица 1. Влияние инокуляции семян пшеницы бактериями B. subtilis 26Д на численность микроорганизмов прилегающей к ним почвы (посев на МПА)
Обработка
Численность, КОЕ/г почвы х 106
2-е сут 4-е сут 7-е сут
Контроль 82 ± 6 125 ± 5 101 ± 10
B. subtilis 26Д (105 кл./мл) 53 ± 7 57 ± 6 69 ± 5
B. subtilis 26Д (106 кл./мл) 114 ± 7 125 ± 10 135 ± 7
месте (25°C) в течение 5 сут и анализировали количество клеток A. vinelandii и B. subtilis в почве описанным выше методом десятикратных разведений, выращивая культуры бактерий в чашках Петри, соответственно, на среде для азотобактера или МПА.
Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью компьютерной программы Microsoft Ехсе1. Данные выражены как средние значения с указанием стандартного отклонения.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Выявлено, что при инокуляции нестерильных семян пшеницы клетками В. зыЫШз 26Д (106 кл./мл) и последующем их внесении в стерильную почву численность микроорганизмов в почве, окружающей семена (в прилипших к семенам частицах почвы) составила 5.5 ± 0.5 КОЕ х 106/г почвы, тогда как в контроле (без инокуляции) — 8.7 ± 1.9 КОЕ х х 106/г почвы. Уменьшение численности эпифит-ных микробов, попавших в стерильну
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.