364 HMMyHoperyA^un
CHARACTERISTICS OF MATURITY AND ADHESION OF NEUTROPHILS
IN PREECLAMPSIA
Panova I. A., Kudryashova A. V., Khlipunova D. A., Smirnova E. V., Rockatanskya E. A.
Ivanovo Research Institute of Maternity and Childhood named by V. N. Gorodkov of the Ministry of Health of Russia, Ivanovo, Russia
The character of the adhesion molecules expression by neutrophils of peripheral blood of women with hypertensive disorders during pregnancy was studied. It was established that the hypertensive disorders in pregnant women were accompanied by the impairment of functional activity of neutrophils and changes of the amount of CD49b+, CD31+ and CD56+ cells in dependence on the genesis of arterial hypertension.
Key words: pregnancy, preeclampsia, neutrophil adhesion molecules
ВЛИЯНИЕ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ НЕЙТРОФИЛОВ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ЕСТЕСТВЕННЫХ КИЛЛЕРНЫХ КЛЕТОК БОЛЬНЫХ МНОЖЕСТВЕННОЙ
МИЕЛОМОЙ
Пазина Т.Ю.12, Кэмпбэлл К.2, Шамова О. В.13
'ФГБУ «НИИ Экспериментальной медицины» СЗО РАМН, Санкт-Петербург, Россия;
2Фокс Чейз Центр, Филадельфия, США; 3Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия
Множественная миелома (ММ) - это злокачественное лимфопролиферативное заболевание плазматических клеток, которое сопровождается различными видами патологии. Несмотря на применение новых иммуномодулирующих препаратов, данное заболевание практически не поддается лечению и имеет рецидивирующее течение болезни. Необходим поиск новых лекарственных препаратов для терапии ММ. Антимикробные пептиды (АМП) - молекулы системы врожденного иммунитета - могут рассматриваться, как перспективные агенты для лечения ММ за счет совокупности иммуномодулирующих и противоопухолевых свойств. Известно, что естественные киллерные (ЕК) клетки играют важную роль в противоопухолевой защите организма, однако при ряде заболеваний, в том числе ММ, их функциональная активность снижается. Стимуляция функциональной активности ЕК клеток может стать одним из путей коррекции опухолевых заболеваний. Нами изучено влияние АМП нейтрофилов (кателицидина человека LL-37 и протегрина 1) на ЕК клетки больных ММ. Показано увеличение экспрессии маркера ранней активации лимфоцитов СБ69 на поверхности ЕК клеток периферической крови пациентов с диагнозом ММ, в присутствии как LL-37, так и протегрина. Полученные данные свидетельствуют о возможности модуляции функциональной активности ЕК клеток антимикробными пептидами врожденного иммунитета.
Ключевые слова: антимикробные пептиды, множественная миелома, естественные кил-лерные клетки
Введение. Множественная миелома (ММ) -злокачественное лимфопролиферативное заболевание, которое сопровождается экспансией клона трансформированных плазматических клеток в костный мозг, что приводит к остео-литическому разрушению костей, гиперкаль-цемии, почечной недостаточности и другим
типам нарушений [1]. Поиск новых средств для лечения ММ является актуальной задачей биомедицины. Исследование природных защитных молекул, которые могут участвовать в реализации механизмов противоопухолевой защиты организма, представляет важное направление фундаментальной и клинической
Тематический выпуск «Российский научный форум на Урале»
365
биомедицины. Одной из групп таких защитных соединений являются антимикробные пептиды (АМП) системы врожденного иммунитета человека и животных. АМП обнаружены практически у всех живых организмов, установлено, что они играют важную роль в инактивации чужеродных организмов [2], а также могут выполнять и другие биологические функции, в том числе проявлять имму-номодулирующие эффекты: хемотаксическая активность (или/и активация продукции хе-мокинов), модулирование функциональной активности дендритных клеток и других клеток адаптивного иммунного ответа, альтерация экспрессии генов [3]. У млекопитающих имеется два основных семейства АМП - ка-телицидины и дефенсины. Некоторые АМП оказывают токсическое действие на опухолевые клетки [4-6], поэтому в настоящее время возрастает интерес к изучению этих пептидов, как потенциальных противоопухолевых препаратов. Хотя изучению прямого цитотокси-ческого действия АМП на опухолевые клетки посвящено большое количество работ, их взаимодействие с другими молекулами и клетками, участвующими в противоопухолевой защите, остается практически не изученным.
Одними из основных компонентов противоопухолевой и противовирусной защиты организма [7] являются естественные киллерные клетки (ЕК) - СБ56+СБ3- большие гранулярные лимфоциты системы врожденного иммунитета. Однако при ММ функции ЕК клеток нарушены, так как опухолевое микроокружение секрети-рует ряд гуморальных факторов, ингбирующих цитотоксическое действие ЕК клеток [8].
Исходя из известных наблюдений об имму-номодулирующих свойствах АМП, мы предположили, что они могут иметь модулирующее действие в отношении ЕК клеток, в частности ЕК клеток больных ММ.
Целью работы явилось изучение влияния двух пептидов, имеющих различные структуры, - кателицидина КЬ-37, присутствующего в нейтрофилах и эпителиальных клетках человека, и кателицидина нейтрофилов свиньи про-тегрина 1 - на функциональную активность ЕК клеток, полученных из крови и аспиратов костного мозга больных множественной миеломой.
Материалы и методы. Влияние кателицидина КЬ-37 и протегрина PG1 на функциональную активность ЕК клеток больных ММ изучали с помощью проточной цитометрии. Лимфоци-
ты периферической крови и аспиратов костного мозга больных ММ получали у пациентов после лечения химиотерапией или трансплантации стволовых клеток из периферической крови. В работе также были использованы лимфоциты периферической крови здоровых доноров. Фракцию лимфоцитов периферической крови и костного мозга выделяли путем центрифугирования в градиенте плотности c применением Lymphoprep (AXIS-SHIELD Poc AS cat#1114544) с использованием стандартной методики. Полученные лимфоциты ресуспен-дировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% плазму. Наличие EK клеток в составе лимфоцитов крови и костного мозга подтверждалось данными цитофлюоримерии. Лимфоциты инкубировали с пептидами в различных концентрациях (1 мкг/мл, 10 мкг/мл, 50 мкг/мл) в течение 24 часов. ^нтролями служили клетки, инкубировавшиеся в тех же условиях, но без добавления пептидов. Через 24 часа оценивали экспрессию маркера ранней активации лимфоцитов CD69 при помощи проточной цитометрии на оборудовании BD FACS Aria II фирмы BD Bioscience с использованием флюоресцентных антител к CD69 и маркерам EK клеток. EK клетки были идентифицированы как CD45+CD3CD56+ лимфоциты с применением антител к CD45 (PerCP-Cy5.5 eBioscience cat #45-9459-42), CD3 (Cy7APC BD Pharmigen cat#560176), CD56 (APC Biolegend cat#318310), CD69 (PacBlue Biolegend cat#310920). Использовали химически синтезированные пептиды LL-37 и PG1 (Anaspec, США). Данные анализировали с применением программного пакета FlowJo Version 9.6.2.
Результаты и обсуждение. В данной работе эффекты действия антимикробных пептидов врожденного иммунитета кателецидина LL-37 и протегрина 1 (PG1) на функциональную активность EK клеток больных ММ оценивались по способности пептидов влиять на экспрессию маркерной молекулы, характеризующей активацию этих клеток - CD69. CD69 - это трансмембранный белок класса II, принадлежащий семейству лектинов С-типа. CD69 вовлечен в процессы активации и экспрессируется на поверхности активированных лимфоцитов - Т, В, EK клеток, эозинофилов и нейтрофилов.
Исследованы эффекты АМП на экспрессию данного маркера на EK клетках, полученных из периферической крови и аспиратов костного мозга больных ММ, а также эффекты АМП
366
Иммунорегуляция
на лимфоциты периферической крови здоровых доноров. После инкубации АМП с ЕК клетками, выделенными из костного мозга больных ММ, достоверных изменений в экспрессии СБ69 по сравнению с контролем (клетки, инкубировавшиеся без АМП) не наблюдалось. Однако, действие пептидов на ЕК клетки, полученные из периферической крови больных ММ, было иным: в присутствии кателецидина ЬЬ-37 в концентрациях 1 мкг/мл, 10 мкг/мл и 50 мкг/ мл экспрессия маркера ранней активации СБ69 повышалась на 52%, 42%, 40%, соответственно, по сравнению с контрольными пробами. В данном диапазоне концентраций ЬЬ-37 не влиял на экспрессию СБ69 на ЕК клетках здоровых доноров, только при использовании пептида в концентрации 100 мкг/мл экспрессия СБ69 достоверно увеличивалась (на 28% по сравнению с контролем). В присутствии другого исследуемого пептида - PG1 экспрессия СБ69 на ЕК клетках больных ММ повышалась при использовании пептида в концентрации 50 мкг/мл (на 48.9% по сравнению с контролем), но не в более низких концентрациях. При этом, в отличие от ЬЬ-37, PG1 оказывал действие и на ЕК клетки здоровых доноров (в концентрации 50 мкг/мл наблюдалось увеличение количества СБ69 в 5.9 раз по сравнению с контрольными пробами). Наблюдаемые различия в эффектах действия пептидов, по-видимому, связаны с особенностями их структур - хотя оба пептида являются катионными амфипа-тическими молекулами, они имеют различные
конформации, что, возможно, обусловливает их взаимодействие с разными мишенями в исследуемых клетках. Изучение влияния АМП других структур на ЕК клетки и выяснение молекулярных механизмов их действия составит предмет нашей последующей работы.
Заключение. Показано модулирующее действие антимикробных пептидов врожденного иммунитета на один из показателей, характеризующих функциональную активность ЕК клеток. Дальнейшее изучение этих эффектов позволит определить их значимость в ходе реализации цитотоксического действия ЕК при ММ. Полученные результаты указывают на возможную биологическую роль АМП в функционировании систем, связанных с противоопухолевой защитой.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Kyle R. A., Rajkumar S. V. Blood 2008, 111, 2962-2972.
2. Hancock R. E.W., Sahl H. G. Nat. Biotechnol. 2006, 24,1551-1557.
3. Lai Y.; Gallo, R. L. Trends Immunol. 2009, 30, 131-141.
4. Moore A. J., Devine D. A., Bibby M. C. Pept Res. 1994 Sep-Oct, 7 (5), 265-9.
5. Cruciani R. A., Barker J. L., ZasloffM., Chen H. C., Colamonici O. Proc Natl Acad Sci U
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.