РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2010, том 50, № 1, с. 58-64
МОДИФИКАЦИЯ РАДИАЦИОННЫХ ЭФФЕКТОВ =
УДК [57+61]::539.1.04:599.323.4/.7:576.3
ВЛИЯНИЕ АНТИОКСИДАНТА ФЕНОЗАНА И ОБЛУЧЕНИЯ В МАЛОЙ ДОЗЕ НА СОДЕРЖАНИЕ БЕЛКОВ р53 И BCL-2 У МЫШЕЙ РАЗНЫХ ЛИНИЙ © 2010 г. Е. М. Миль*, А. А. Албантова, Е. Б. Бурлакова
Институт биохимической физики им. Н.М. Эммануэля, Москва
Исследовано влияние антиоксиданта фенозана на содержание белков апоптозного ряда, а также способность фенозана модифицировать радиационные эффекты, определяемые по уровню содержания белка — регулятора апоптоза р53 и антиапоптозного белка Ьс1-2 у мышей разных линий, различающихся по вероятности возникновения спонтанного лейкоза; лейкозной линии АКР и у мышей-гибридов Б1(СВЛ х С57В1), отличающейся низким процентом раковых заболеваний и по чувствительности к облучению. Антиоксидант фенозан в сверхмалой дозе 10-14 моль/кг и при концентрации 10-4 моль/кг, как обнаружено, вызывает увеличение содержания регуляторных белков — белка контроллера апоптоза р53 и антиапоптозного белка Ьс1-2 в сыворотке крови у мышей низкораковой линии Б1(СВЛ х С57В1) и у мышей лейкозной линии АКР. Одновременное увеличение уровня содержания этих белков под действием фенозана может свидетельствовать о преобладании процессов репарации над процессами апоптоза, что коррелирует с ранее полученными данными по снижению содержания двунитевых разрывов ДНК в клетках мышей линии АКР и Б1 после воздействия фенозана. Конститутивный уровень содержания белков р53 и Ьс1-2 у мышей линии АКР оказался существенно выше, чем у мышей линии Б1(СВЛ х С57В1) того же возраста, что может быть связано с накоплением мутантного белка р53 при лейкозе, а также наличием вирусного заражения 3-4-месячных лейкозных мышей АКР. Показано также, что у мышей-гибридов Б1(СВЛ х С57В1) содержание белка р53 под действием суммарного воздействия обучения и фенозана повышалось по отношению к воздействию только фенозана, что, вероятно, обусловлено стимуляцией различных сигнальных путей, приводящих к активации белка р53, вызванной фенозаном или действием облучения в малой дозе.
Мыши, линия АКР, гибриды ¥1(СВЛ хС57В1), селезенка, белокр53, белок Ьс1-2, ионизирующее излучение, малые дозы, фенозан.
В связи с проблемой изыскания химических соединений со свойствами эффективных антиок-сидантов в ИБХФ РАН был синтезирован препарат фенозан — (р-(4-гидрокси-3,5-дитретбутил-фенил) пропионовой кислоты), эффективный антиоксидант, широко применяемый для защиты полимеров и других продуктов органического происхождения от окисления. Оказалось, что при введении в организм фенозан проявляет широкий спектр воздействий — антимикробные и про-тивоэпилептические свойства, обнаруживает антиожоговое и радиопротекторное действие, а также предотвращает возникновение инфарктов и инсультов [1—3].
Ранее было показано, что антиоксидант фено-зан, введенный до или после облучения мышей в дозе 15 Гр, снижает интенсивность окислительных процессов в липидах после облучения [4]. Он также оказывал положительное влияние на отда-
*Адресат для корреспонденции: 119991 Москва, ГСП-1, ул. Косыгина, 4, ИБХФ РАН; тел.: (495) 939-74-81; факс: (499) 137-41-01; e-mail: elenamil2004@mail.ru.
ленные пострадиационные изменения в структуре ДНК головного мозга при облучении мышей линии СВА в сублетальной дозе 150 сГр [5]. В то же время введение фенозана в сверхмалой дозе 10-14 моль/кг мышам линии АКР в возрасте 3—4 мес приводило к уменьшению поражения животных лейкозом и к существенному увеличению продолжительности их жизни в случае поражения вирусом лейкоза Гросса [6, 7].
Было обнаружено, что при введении фенозана мышам линии Б1(СВЛ х С57В1) в сверхмалой дозе 10-14 моль/кг и в дозе 10-4 моль/кг происходит увеличение содержания белка р53 [8]. Можно было полагать, что существенное положительное воздействие фенозана в малых и терапетических дозах на животных, в том числе на последствия облучения [5, 6], обусловлено его влиянием на процессы репарации и апоптоза. Поэтому в работе было изучено влияние антиоксиданта феноза-на в дозах 10-14 моль/кг и 10-4 моль/кг, при однократном и многократном введении, а также при сочетании воздействия гамма-излучения в малой дозе 1.2 сГр и фенозана, на содержание белка ре-
гулятора апоптоза p53 и антиапоптозного белка bcl-2 в сыворотке крови мышей.
Контролер клеточного цикла белок р53 и его содержание в клетке могут служить показателем системного ответа организма на различные воздействия, стимулируя большое число клеточных генов, включая проапоптические гены [9, 10]. Ген р53 (Puma) активируется в клетке при ряде воздействий: при облучении, генотоксическом стрессе или в ответ на повреждение ДНК [11, 12]. Сам ген р53 часто мутирует в опухолевых и лей-козных клетках, что приводит к появлению му-тантного, более стабильного белка с утраченной функцией надзора за структурой ДНК, свойственной белку р53 дикого типа. Это приводит к тому, что содержание белка p53 возрастает при ряде опухолевых заболеваний, в том числе при развитии лейкозов [13, 14, 15].
Избыточная экспрессия гена р53 при больших дозах облучения часто приводит к нежелательному апоптозу и гибели клеток, которому противостоит система антиапоптозных белков, ряда членов семейства протоонкогенов, к которому относится белок bcl-2. При этом сверхэкспрессия гена BCL-2 противодействует радиационно-индуци-рованному апоптозу в клетках гемопоэза, а дефицитные по bcl-2 мышиные клетки, напротив, проявляют большую радиочувствительность [16, 17]. Механизм действия белка bcl-2 в регуляции апоптоза многогранен, и связан, в частности, с подавлением активности киназ JNK и MEKK1 (киназы МАР каскада), а также взаимосвязан с белком р53, подавляющим транскрипцию гена BCL-2. Повышение концентрации белка bcl-2 негативно воздействует на каспазу 1, препятствуя апоптозу [16]. Определение содержания белка bcl-2 может быть показателем направленности протекания метаболитических процессов в сторону репарации или апоптоза клеток и, следовательно, служить параметром для прогнозирования последствий воздействия химиотерапии или облучения на организм человека и животных.
Реакция p53 на облучение in vivo относительно хорошо изучена и, как было показано, имеет сложный характер, зависит от интенсивности облучения и типа тканей, клеток, объектов [11, 12, 18-20].
Содержание белка р53 обычно возрастает при действии облучения, однако в ряде случаев было обнаружено, что облучение мышей лейкозной линии АКР [8, 18] и других биообъектов [19, 20] в сверхмалых дозах может способствовать супрессии белка р53 за счет индукцией иной последовательности генов под действием облучения в сверхнизких дозах, а также при опухолевой трансформации [12]. Важно было сравнить эффект действия излучения в сверхмалых дозах на мышей низкораковых гибридов F1(CBA х C57Bl), устойчивых к действию радиации и лейкозной
линии АКР, а также исследовать эффект воздействия излучения после введения фенозана, по изменению содержания белка р53 в сыворотке крови мышей двух линий.
Что касается индукции генов антагонистов BAX и BCL-2 и соответствующих белков bax и bcl-2, участвующих в пути апоптоза, то как было обнаружено ранее, она зависит от дозы облучения, и с увеличением последней наблюдается эффект переключения экспрессии генов [11, 21, 22]. Измерение уровня экспрессии генов и содержания белков bax и bcl-2 в клетках-промиелоцитах человека показало, что содержание белка bax увеличивается, а bcl-2 снижается через 1 ч после облучения в летальной дозе 8 Гр, приводя к гибели клеток путем апоптоза [22]. Облучение мышей в сублетальной дозе 0.1 Гр через 1 ч уже дает значительную стимуляцию гена р53 (Puma), а в дозе 0.2 Гр гена Bax — индуктора апоптоза, антагониста Bcl-2, которая достигает максимума через 3 ч [11].
С другой стороны при повреждении ДНК в результате облучения в малой дозе (20 сГр) в периферических лимфоцитах крови обнаруживалась индукция генов р53 и Bcl-2 [11], а также увеличение содержания белка bcl-2 у мышей- гибридов F1 линий (CBA х C57Bl) [21].
Отмечается, что другие стрессовые воздействия, губительные для клеток, в том числе нагревание клеток HL60 при 43 град в течение 1 ч, приводит к увеличению экспрессии гена Bax, такому же как и при облучении в дозе 8 Гр [22].
Целью настоящего сравнительного исследования явилось изучение способности антиоксиданта фено-зана влиять на механизмы модуляции апоптоза и репарации ДНК, а также способность модифицировать радиационные эффекты по показателю содержания белка-регулятора р53 и антиапоптозного белка bcl-2 у мышей разных линий, различающихся по вероятности возникновения спонтанного лейкоза: у животных высокораковой линии АКР и у низкораковых мышей — гибридов F1(CBA х C57Bl), отличающихся также и по чувствительности к облучению.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Опыты проводили на 3-месячных мышах-самках линии АКР и мышах-гибридах F1(CBA х C57Bl) массой 19—20 г. Контрольная группа, как и опытная группа, состояла из 8—10 особей. Облучение животных проводили на у-установке "ЭЦУ-100" 137Cs с энергией 150—200 КэВ в дозе 1.2 сГр.
В разной серии опытов фенозан в виде водного раствора вводили мышам однократно или 4-кратно до облучения, доводя его концентрацию в организме до 10—14 или 10—4 моль/кг. Контрольным животным вводили соответствующий водный растворитель без фенозана. Через 1 сут после вве-
Количество р53, отн.ед. 3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
1-е сут
Количество pbcl-2, отн.ед.
2.5 г ^
2.0 1.5 1.0 0.5
0
4-е сут
1-е сут
4-е сут
К
П фенозан 10 14 моль/кг ■ фенозан 10-4 моль/кг
Рис. 1. Изменение количества белка р53 (а) и белка Ьс1-2 (б) в сыворотке крови мышей АКР на 1-е и 4-е сут после однократного введения фенозана.
дения препарата опытных животных подвергали низкодозовому облучению в течение 2 сут. Препараты сыворотки крови (и белковые экстракты ткани селезенки мышей) брали на разные сутки после облучения. Контрольные препараты сыворотки крови мышей выделяли на те же сутки, что и опытные.
Для определения белка р53 в сыворотке крови использовали метод иммуноблоттинга. Белки сыворотки крови разделяли
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.