ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 4, с. 485-492
УДК 581.1
ВЛИЯНИЕ АТФ ИА СОДЕРЖАНИЕ НЕАКТИВНЫХ КОМПЛЕКСОВ ФС II У ХЛОРЕЛЛЫ
© 2004 г. Ю. К. Чемерис, Н. С. Корольков, Н. X. Сейфуллина, А. Б. Рубин
Кафедра биофизики биологического факультета Московского государственного университета
им. М.В. Ломоносова, Москва Поступила в редакцию 22.04.2003 г.
Длительная (20 ч) темновая инкубация при 37°С водоросли Chlorella pyrenoidosa Chick приводила к двухкратному возрастанию вклада медленной (время нарастания 10-15 мин) фазы (mFv) в кинетике нарастания переменной флуоресценции хлорофилла (Fv, где Fv = Fm - F0) у обработанных диуроном клеток. Последнее указывает на накопление неактивных комплексов ФС II, обладающих низкой эффективностью восстановления QA. Присутствие в среде инкубации метиламина, оказывающего разобщающий эффект на тилакоидные мембраны, или ингибитора АТФ-синтазы - дециклогексил-карбодиимида предотвращало накопление неактивных комплексов ФС II. Экзогенная АТФ на фоне увеличения восстановленности пула пластохинона в присутствии салицилгидроксамата стимулировала накопление неактивных комплексов. Темновое окисление пластохинона в присутствии неме-таболизируемого аналога глюкозы 2-дезокси-Б-глюкозы приводило к снижению содержания неактивных комплексов ФС II. Ингибитор хлоропластных фосфатаз - NaF замедлял этот процесс. Полученные результаты рассматриваются как свидетельство существования механизма, регулирующего содержание неактивных комплексов ФС II в процессе редокс-зависимого фосфори-лирования D1- и (или) Б2-белков ФС II.
Chlorella pyrenoidosa - переменная флуоресценция хлорофилла - QA - ФС II - регуляция
Изменение активности и состава фотосинтетического аппарата высших растений и водорослей в значительной степени определяется действием регуляторных механизмов, в основе которых лежит фосфорилирование белков тилакоидных мембран [1-3]. Наиболее полно изучен процесс регуляции соотношения циклического и нециклического транспорта электронов при обратимом фосфорилировании белков светособирающего хлорофилл-белкового комплекса [1, 2, 4].
В последние годы показано [5, 6], что редокс-зависимое фосфорилирование Б1-белка хлорофилл-белкового комплекса ФС II также имеет принципиальное значение для регуляции фотосинтетической активности, в частности, в процессе фотоповреждения и репарации поврежденных комплексов ФС II в экстремальных условиях.
Сокращения: ^о - начальный и Рт - максимальный выходы флуоресценции хлорофилла; Fv - переменная флуоресценция хлорофилла; мFv - медленная и б^ - быстрая фазы в кинетике нарастания Fv; РЦ - реакционные центры; QA -первичный хинонный акцептор электронов; 2ДБГ - 2-дез-окси-Б-глюкоза, ДЦКД - дициклогексилкарбодиимид; СГ -салицилгидроксамат.
Адрес для корреспонденции: Чемерис Юрий Константинович. 119899 Москва, Московский государственный университет, биологический факультет, кафедра биофизики. Факс: 07 (095) 939-11-15, электронная почта: chemeris@biophys.msu.ru
Помимо этого, с фосфорилированием основных белков ФС II связывают снижение фотосинтетической активности в результате изменения констант связывания первичных хинонных акцепторов электронов ФС II [1, 2]. Последнее может быть обусловлено повышением плотности поверхностного отрицательного заряда на фос-форилированных Б1- и Б2-белках реакционных центрах (РЦ) ФС II.
Несомненно, что уменьшение константы связывания первичного хинона на Б2-белке и, соответственно, снижение вероятности его восстановления должно сопровождаться замедлением нарастания переменной флуоресценции - Fv, которая, как известно [7], отражает накопление РЦ ФС II с восстановленным первичным хинонным акцептором электронов ^А). По-видимому, медленная фаза - мFv (со временем нарастания в несколько минут) в кинетике нарастания Fv у обработанных диуроном клеток хлореллы [8], амплитуда которой зависит от редокс-состояния пластохинона [9] и характеризует функционирование фракции комплексов ФС II с дестабилизированным на Б2-белке QA.
Если уменьшение константы связывания QA действительно определяется фосфорилированием основных белков ФС II, следует ожидать, что содержание комплексов ФС II с дестабилизиро-
о
о &
«
Ф К
Л Й
н ° о о к я к
и и я
„ к о о ¡А Я
<0 н к S
F
•F..
F0
2 мин
Рис. 1. Изменение выхода флуоресценции хлорофилла, возбуждаемой короткими вспышками света, у хлореллы, инкубированной 20 ч в темноте при 37°С.
и Рт - соответственно начальный (темновой) и максимальный уровень флуоресценции хлорофилла; м^ и б^ - соответственно медленная и быстрая фаза нарастания переменной флуоресценции, где м^ + + бFV = ГV = Рт - ^о. Ломаными стрелками отмечено начало импульсного освещения клеток; прямыми стрелками, направленными вверх и вниз, отмечены моменты включения и выключения дополнительного постоянного света (7 Вт/м2); пунктирной стрелкой указан момент добавления 5 мкМ диурона.
ванным Од и амплитуда характерной для них мFV будут зависеть не только от редокс-состояния плас-тохинона [9], но и от обеспеченности клеток АТФ. Такое предположение основано на том факте, что протеинкиназы, фосфорилирующие белки тила-коидных мембран, используют АТФ в качестве донора фосфатных групп, а их активность находится под редокс-контролем пластохинона [1, 2]. С целью проверки этого предположения в настоящей работе стояла задача исследовать влияние обеспеченности клеток АТФ на соотношение медленной и быстрой фаз в кинетике нарастания переменной флуоресценции.
МЕТОДИКА
В качестве объекта исследования использовали аксеничную культуру одноклеточной зеленой водоросли Chlorella pyrenoidosa Chick, термофильный штамм DMMSU S-39 из коллекции кафедры микробиологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.
Культуру водоросли выращивали на 20%-ной среде Tamiya [10] в цилиндрических стеклянных термостатируемых культиваторах (250 мл) при освещении люминесцентными лампами с интенсивностью света 30 Вт/м2 на поверхности культиватора при 37°С и постоянной аэрации очищенным воздухом, необогащенным С02. Во время темновой инкубации суспензию клеток водоросли также аэ-
рировали воздухом. Концентрация клеток в экспериментах не превышала 5 млн. клеток/мл.
Методика измерения переменной флуоресценции хлорофилла хлореллы проиллюстрирована на рис. 1 на примере клеток, инкубированных 20 ч в темноте при 37°С. Начальную интенсивность флуоресценции ^0) измеряли с помощью импульсного флуориметра, освещая клетки серией зондирующих слабых и коротких вспышек света (50 мкс, 1 мкДж), каждая из которых вызывает срабатывание не более, чем 3% РЦ ФС II, имеющихся в образце [11]. Интенсивность флуоресценции на уровне Fm при восстановленном первичном хинонном акцепторе Од измеряли аналогичным образом, но при дополнительном освещении постоянным светом (7 Вт/м2) клеток, обработанных диуроном (5 мкМ). Как видно из рис. 1, освещение в присутствии диурона клеток хлореллы вызывало двухфазное увеличение выхода флуоресценции от темнового (начального, F0) уровня до максимального ^т) уровня, характерного для РЦ ФС II, находящихся в "закрытом" состоянии с восстановленным Од. Время нарастания быстрой фазы (бFV) в кинетике Fv (где Fv = = Fm - F0) составляло менее 1 с. Медленная фаза (мFV) со временем нарастания несколько минут являлась основной у клеток хлореллы, инкубированной 20 ч в темноте, и составляла до 70% от Fv (где Fv = бFV + мFV = Fm - F0). Для характеристики изменения кинетики нарастания Fv использовали величину отношения амплитуд мFV и бFV (мFV/бFV.), а также величину относительного вклада амплитуды медленной (мFV/FV), и быстрой фаз (бFV /FV) в амплитуду Fv.
Светоиндуцированное выделение кислорода целыми клетками водоросли измеряли с помощью электрода Кларка в закрытой ячейке.
Все эксперименты были выполнены не менее, чем в 5 повторностях. На рисунках и в таблицах представлены результаты типичных экспериментов.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Как видно из данных, представленных на рис. 2 (кривая 1), длительная темновая инкубация при 37°С клеток хлореллы сопровождается изменением кинетических характеристик переменной флуоресценции хлорофилла - Fv. По мере темновой инкубации возрастает относительный вклад медленной фазы (мFV) в кинетике нарастания Fv и, соответственно, уменьшается относительный вклад быстрой фазы (бFV). В результате за 20 ч отсутствия освещения величина отношения мFV/бFV возрастает от 0.45-0.50, значения, характерного для культуры водорослей, растущей на свету, до 2.0-2.5. Присутствие в среде культивирования разобщителя фотофосфорилирования
2
1
0
метиламина (10 мМ) полностью предотвращало эффект нарастания mFv (рис. 2, кривая 2). Однако, если к клеткам, инкубированным 20 ч в темноте с метиламином добавляли АТФ (1 мМ), то наблюдали хотя и незначительное, но достоверное возрастание значения mFv/6Fv (рис. 2, кривая 5). Метиламин не только предотвращал увеличение относительного вклада mFv, но и вызывал значительное уменьшение относительного вклада mFv у клеток, проинкубированных 20 ч в темноте при 37°С (рис. 2, кривая 3).
АТФ (1 мМ), добавленная одновременно с метиламином (10 мМ) к клеткам водоросли, проинкубированным 20 ч в темноте, предотвращала действие разобщителя - величина отношения mFv/6Fv снижалась в этом случае от 2.0-2.2 до 1.6, а не до значения 0.75, как в присутствии только метиламина. Разобщитель окислительного фос-форилирования 2.4-ДНФ (20 мкМ) не оказывал влияния на нарастание относительного вклада mFv во время темновой инкубации хлореллы. Предварительно [12] было показано, что в этой концентрации 2.4-ДНФ ускорял темновое дыхание водоросли не менее, чем на 40%.
В присутствии салицилгидроксамата (СГ) (5 мМ), ингибирующего у хлореллы кислород-зависимое окисление пластохинона [13], и тем самым увеличивающего степень его восстановленное™ [14], величина отношения mFv/6Fv уже за 20 мин темновой инкубации возрастала до 0.7 (табл. 1), тогда как без СГ амплитуда медленной фазы в кинетике фотоиндуцированного нарастания Fv практически не изменялась за это время. Клетки без СГ требовалось инкубировать не менее 3 ч в темноте, чтобы величина mFv/6Fv возросла до 0.75 (рис. 2). Экзогенная АТФ, доб
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.