НЕЙРОХИМИЯ, 2007, том 24, № 2, с. 138-142
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.156
ВЛИЯНИЕ АТРОПИНА НА АКТИВНОСТЬ КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ Н И ФЕНИЛМЕТИЛСУЛЬФОНИЛФТОРИД-ИНГИБИРУЕМОЙ КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ В ОТДЕЛАХ МОЗГА И НАДПОЧЕЧНИКАХ КРЫС
© 2007 г. М. Т. Генгин, В. Б. Соловьев*
Кафедра биохимии Пензенского государственного педагогического университета им. В.Г. Белинского
Изучено влияние однократного воздействия атропина на активность карбоксипептидазы Н и фе-нилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы - ферментов, участвующих в конечной стадии образования биологически активных нейропептидов из предшественников. Наблюдалось длительное, сохраняющееся, по крайней мере, в течение 72 ч снижение активности исследуемых ферментов. Предполагается, что снижение активности исследуемых ферментов может быть одним из механизмов снижения уровня нейропептидов при действии высоких доз атропина.
Ключевые слова: карбоксипептидаза Н, фенилметилсульфонилфторид-ингибируемая карбокси-пептидаза, атропин, нейропептиды, мозг.
Холинотропные препараты оказывают свое действие практически на все регуляторные системы. Особый интерес представляет изучение их взаимодействия с пептидергической системой, поскольку нейропептиды участвуют в регуляции разнообразных нейрофизиологических процессов и соматических функций, в том числе тех, которые нарушаются при отравлении холиноблокаторами [1-3]. Общепризнано, что первичная фармакологическая реакция центральных холинотропных препаратов связана с активацией или блокированием холинорецепторов [4]. Однако многообразие фармакологических эффектов (в частности, транквилизирующее, анальгезирующее влияние и т.д.) препаратов этой группы трудно объяснить только с этой позиции. Исследования показали, что действие этих препаратов на обмен медиаторов (норадреналина, серотонина, дофамина) [5], фосфолипидов и синтез белка [6] не дает возможности в полной мере объяснить механизм их действия.
Имеется большое количество литературных данных об изменении концентрации регулятор-ных пептидов в мозге и сыворотке крови животных при действии холинолитиков [7, 8]. Однако молекулярные механизмы действия холинотропных препаратов на уровень биологически активных пептидов не изучены.
Активная форма регуляторных пептидов образуется в результате протеолитического процессин-га пропептидов. На конечных стадиях этого процесса, в результате которого образуются биологи-
* Адресат для корреспонденции: 440026, Пенза, ул. Лермонтова, 37; тел.: 8 (8412) 55-32-62; e-mail: solowew@rambler.ru
чески активные пептиды, участвуют основные карбоксипептидазы, в частности, карбоксипептидаза Н (КПН, КФ 3.4.17.10) и фенилметилсуль-фонилфторид-ингибируемая карбоксипептидаза (ФМСФ-КП) [9, 10]. КПН локализована в секреторных везикулах и вовлекается в процессинг предшественников многих регуляторных пептидов [9, 10]. ФМСФ-КП - недавно описанный фермент [10], субстратная специфичность и тканевая локализация которого позволяют предположить возможность его вовлечения в обмен ряда биологически активных пептидов, в особенности опио-идных [10]. Однако биологическая роль этого фермента во многом остается неясной.
В связи с этим целью данной работы было изучение активности КПН и ФМСФ-КП при однократном введении атропина в отделах головного мозга и надпочечниках крыс, характеризующихся высоким уровнем регуляторных пептидов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Опыты выполнены на самцах белых беспородных крыс массой 200-300 г. Атропин вводили вну-трибрюшинно в физиологическом растворе в дозе 2.5 мг/кг. Контрольной группе животных вводили равное количество физиологического раствора. Крыс декапитировали через 0.5, 4, 24 и 72 ч после инъекции, извлекали надпочечники, головной мозг, и разделяли его на соответствующие отделы. Навески ткани гомогенизировали в 50 мМ натрийацетатном буфере, содержавшем 50 мМ №С1, рН 5.6, в соотношении 1 : 50 (вес : объем). В полученном гомогенате определяли активность КПН и ФМСФ-КП флуорометрическим методом
ВЛИЯНИЕ АТРОПИНА НА АКТИВНОСТЬ КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ H
139
L.D. Flicker and S.H. Snyder [11], содержание белка -методом Лоури [12].
Активность КПН оценивали по гидролизу дан-сил-Phe-Ala-Arg при рН 5.6 как ингибируемую высокоспецифичным ингибитором фермента гуаниди-ноэтилмеркаптоянтарной кислотой (ГЭМЯК) [11]; ФМСФ-КП - по гидролизу дансил-Phe-Leu-Arg при рН 5.6 как ингибируемую ФМСФ [10]. Опытные пробы содержали 50 мкл гомогената и 150 мкл 50 мМ натрийацетатного буфера, содержавшего 50 мМ NaCl. В контрольные пробы вносили ГЭМЯК (в случае КПН) и ФМСФ (в случае ФМСФ-КП) в конечной концентрации 1 мкМ и 1 мМ соответственно. Пробы преинкубировали в течение 8 мин при 37°C, затем вносили 50 мкл предварительно нагретого до 37°C раствора субстрата (концентрация в пробе 42 мкМ), приготовленного на том же буфере, и инкубировали в течение 60 мин при 37°C. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 1 М раствора HCl. Для экстракции продукта реакции (дансил-Phe-Ala в случае КПН и дансил-Phe-Leu в случае ФМСФ-КП) к пробам приливали по 1.5 мл хлороформа, интенсивно встряхивали в течение 60 с. Хлороформную и водную фазы разделяли центрифугированием в течение 10 мин при 1000 об/мин.
Флуоресценцию хлороформной фазы измеряли на флуориметре ФМЦ-2 при = 360 нм и
= 530 нм в кювете толщиной 1 см. В качестве стандарта использовали 2 мкМ раствор дансил-фен-ала в хлороформе.
Активность фермента определяли как разность прироста флуоресценции в пробах, не содержащих и содержащих ингибитор, и выражали в нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.
Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием ¿-критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Введение атропина в дозе 2.5 мг/кг вызывало снижение активности КПН в гипофизе через 0.5 и 4 ч после инъекции (рис. 1). В обонятельном мозге активность исследуемого фермента снижалась через 24 ч на 55% и оставалась сниженной спустя 72 ч после введения (на 13%). В четверохолмии обнаружено снижение активности КПН через 0.5, 24 и 72 ч, при этом максимальное снижение активности фермента (на 55%) наблюдается через 72 ч после инъекции. В продолговатом мозге активность КПН была снижена через 4 и 72 ч на 45-50%, тогда как через 0.5 и 24 ч не отличалась от контрольной группы. Введение атропина вызывало снижение активности исследуемого фермента в гипоталамусе во всех исследуемых промежутках времени на 35-40%. В гиппокампе и стри-атуме активность КПН через 0.5 ч снижалась на
30-40%, через 4 ч - на 40-45% и через 72 ч - примерно на 30%. В надпочечниках достоверное изменение активности отмечено только через 72 ч после введения атропина: снижение на 60% по отношению к контролю.
Таким образом, введение атропина в дозе 2.5 мг/кг вызывает длительное, сохраняющееся, по крайней мере, 72 ч снижение активности КПН во всех отделах мозга и надпочечниках крыс.
Результаты исследования влияния атропина (2.5 мг/кг) на активность фенилметилсульфонил-фторид-ингибируемой карбоксипептидазы в отделах мозга и надпочечниках крыс представлены на рис. 2. В гипофизе наблюдалось снижение активности ФМСФ-КП через 0.5 ч на 70%, а через 4 ч на 95% по сравнению с контрольной группой. В надпочечниках снижение активности исследуемого фермента наблюдалось спустя те же промежутки времени: через 0.5 ч на 35% и на 70% по прошествии 4 ч. В обонятельном мозге активность ФМСФ-КП снижалась по сравнению с контрольными животными на 35% через 4 и 24 ч. В четверохолмии и стриатуме активность исследуемой карбоксипептидазы через 4 ч была на 3035% ниже, чем у контрольной группы. Атропин не оказывал влияния на активность ФМСФ-КП в продолговатом мозге на протяжении всего времени исследования. В гипоталамусе активность фермента снижалась только через 72 ч после инъекции. В гиппокампе активность ФМСФ-КП снижалась в 2 раза относительно контроля через 0.5 и 24 ч.
Таким образом, введение атропина в дозе 2.5 мг/кг вызывало снижение активности ФМСФ-КП во всех отделах мозга и надпочечниках крыс, кроме продолговатого мозга.
Несмотря на общую тенденцию снижения активности исследуемых ферментов в мозге и надпочечниках при введении атропина, имеют место и некоторые различия в степени снижения активности карбоксипептидазо-В-подобных ферментов. Так, наиболее существенное снижение активности в гипофизе при действии атропина наблюдалось для ФМСФ-КП - на 75% через 0.5 ч после инъекции и на 95% через 4 ч после введения, в то время как для КПН отмечено снижение активности лишь на 30%. Гипофиз является отделом, синтезирующим и/или секретирующим большой спектр регуляторных пептидов [10, 11]. По-видимому, КПН принадлежит преобладающая роль в процессинге большинства пептидов - тропных гормонов, окситоцина, вазопрессина, атриально-го натрийуретического пептида, вещества Р и др. [10, 11]. ФМСФ-КП, вероятно, участвует в процессинге опиоидных пептидов, синтезирующихся в гипофизе - энкефалинов и в-эндорфина - уровень которых, по данным других авторов [5, 7], значительно снижается при введении атропина.
1.4 1.2 1.0
0.8 0.6 0.4 0.2 0
0.45
Гипофиз
0.30 0.25
л 0.20 к
^ 0.10
2 0.05 * 0
н
§ 0.35 -§0.30
I 0.25 к 0.20 0.15 0.10 0.05 0
0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0
0.35 г 0.30 -0.25 -0.20 0.15 0.10 0.05 0
Обонятельный мозг
** г'п
и!
Четверохолмие
Гипоталамус
Стриатум
0.5 ч
4 ч
24 ч
72 ч
0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0
0.18 0.16 0.14 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0
Гиппокамп
*
I
Надпочечники
0.5 ч 4 ч
24 ч
Продолговатый мозг
II»
72 ч
Рис. 1. Активность КПН при действии атропина в нервной ткани крыс (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, М ± т, п = 4-6). Здесь □ - контроль, ■ - атропин 2.5 мг/кг. * р < 0.05, ** р < 0.01, *** р < 0.001 относительно контроля.
Снижение активности ФМСФ-КП в наших опытах при введении атропина может свидетельствовать о вовлечении данного фермента преимущественно в обмен энкефалинов.
Обращает на себя внимание тот факт, что в надпочечниках наиболее существенное снижение активности отмечено для ФМСФ-КП, в то время как для гипоталамуса и стриатума наиболее выраженные и
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.