ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 2, с. 217-222
УДК 581.1
ВЛИЯНИЕ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ СОЛЕЙ НА СОДЕРЖАНИЕ ЦИТОКИНИНОВ В ИЗОЛИРОВАННЫХ ЛИСТЬЯХ ПШЕНИЦЫ
© 2007 г. Л. Б. Высоцкая*, Л. Н. Тимергалина*, С. Ю. Веселов**, Г. Р. Кудоярова*
*Институт биологии Уфимского научного центра Российской академии наук, Уфа **Башкирский государственный университет, Уфа Поступила в редакцию 12.07.2006 г.
При помощи иммуноферментного анализа исследована динамика содержания цитокининов в изолированных листьях проростков пшеницы (Triticum durum, сорт Безенчукская 139), которые смачивали нитратом аммония или водой (контроль). Обработка листьев водой сопровождалась временным накоплением цитокининов, что могло быть результатом высвобождения их из О-глюкозилирован-ных форм. Обнаруженное повышение содержания зеатина и его рибозида после первоначального снижения в изолированных листьях, которые обрабатывали нитратом аммония, не могло быть результатом их высвобождения из запасных форм (нуклеотиды, О-глюкозиды), так как содержание зеатина и его рибозида увеличивалось одновременно со связанными формами. Накопление изопен-тениладенозина и нуклеотида зеатина, наблюдаемое одновременно с повышением содержания зеатина и его рибозида, позволяет предположить, что цитокинины могут синтезироваться в изолированных листьях пшеницы при обработке их раствором нитрата аммония.
Triticum durum - цитокинины - азотное питание - нитрат аммония
ВВЕДЕНИЕ
Изоляция листьев ускоряет их старение, что проявляется в нарушении структуры и функции фотосинтетического аппарата. Снижение содержания хлорофилла является одним из показателей старения листьев [1]. Быстрое старение срезанных листьев может замедляться экзогенными цитокининами [2]. Это происходит благодаря активации антиоксидантной системы [3] и синтеза каротиноидов [4]. В литературе также описаны факты ускорения старения листьев при обработках высокими концентрациями цитокининов [5] и зависимость этого процесса от света [6]. В этой работе мы обрабатывали изолированные листья пшеницы растворами азотсодержащих солей; такая обработка, по данным литературы, замедляет потерю хлорофилла и естественным путем повышает содержание в листьях цитокининов [7, 8], что согласуется с предполагаемым вовлечением цитокининов в замедление процессов старения.
До сих пор считали, что листья многих видов зависят от доставки цитокининов из корней [9]. Изоляция листьев от источника цитокининов мо-
Сокращения: 3 - зеатин; ЗН - нуклеотид зеатина; ЗР - ри-бозид зеатина.
Адрес для корреспонденции: Высоцкая Лидия Борисовна. 450054 Уфа, пр. Октября, 69. Институт биологии Уфимского научного центра РАН. Факс: 007 (3472) 53-35-62; электронная почта: vysotskaya@anrb.ru
жет быть одной из причин их старения [10, 11]. Обнаружено, что в интактном растении действие нитратов на индукцию ряда генов опосредовано цитокининами [12, 13], а экзогенное применение цитокининов изменяет экспрессию ряда генов, регулирующих метаболизм азота [14]. Вместе с тем, появляются публикации, в которых показано, что экспрессия генов, кодирующих изопенте-нилтрансферазы, не только происходит в побеге интактного растения, но и может изменяться в зависимости от условий [15]. Чтобы проверить существование предполагаемых путей поддержания необходимого уровня цитокининов в листе, мы исследовали динамику различных производных зеатина в срезанных листьях проростков пшеницы, которые обрабатывали водой или раствором NH4NO3. Наши исследования могут быть полезными с точки зрения выяснения возможных источников и механизмов повышения содержания цитокининов в листьях. Такими механизмами могут быть как замедление их распада, так и высвобождение из запасных форм или, возможно, синтез de novo.
МЕТОДИКА
Семена пшеницы (Triticum durum, сорт Безенчукская 139) проращивали в темноте при 24°C на водопроводной воде в течение трех дней, а затем переносили на 10%-ный раствор Хогланда-Арно-на и помещали на светоплощадку, где выращива-
се ^
ч d ч ^ н ^
fs
о
ч
*
« &
я ^ к 8
^ и
^ ^
& Ч
и °
о к
1200 1000 800 600 400 200
Q_
-i 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
се ^
5 3 я о н о
св с« U g
ш *
о JH
ы о я &
се 3 * «
6 ^ ^ е
гЯ «3
Я
до контроль 10 мМ 20 мМ изоляции нитрат нитрат
аммония аммония
Рис. 1. Содержание хлорофилла а и Ь (1) и зеатина (2) в листьях пшеницы до изоляции и через пять дней после изоляции.
После изоляции листья четыре раза в день смачивали водой (контроль) или растворами нитрата аммония (10 и 20 мМ).
ли в течение недели при температуре 24—25°С и освещенности 90 Вт/м2 (лампы ZN и DNAT-400) при 14-часовом фотопериоде. Затем отрезали первые, полностью сформированные листья и помещали их в пробирки с дистиллированной водой. Срезанные листья четыре раза в день обрабатывали раствором NH4NO3 (10 или 20 мМ) в 0.05%-ном Твин-60 на протяжении 5 дней. Контрольные листья в те же сроки обрабатывали 0.05%-ным раствором Твин-60.
Сумму хлорофиллов (a + b) определяли в аликвоте спиртового экстракта, полученного из навески побегов. Оптическую плотность раствора измеряли при длине волны 652 нм. Расчет вели по формуле Бруинзма и Холдена [16]. Результаты рассчитывали в нмоль/г сырой массы растения.
Концентрацию цитокининов определяли по уже описанной методике [17]. Водный остаток спиртового экстракта листьев концентрировали на С18 картридже (RP-C18, "Varían", США). После промывки колонки с образцом дистиллированной водой цитокинины элюировали 80%-ным этанолом. Растворитель упаривали, сухой остаток растворяли в 0.02 мл 80%-ного этанола и наносили на пластинку с силуфолом (силикагель 60 F-254, "Merck", Германия) для разделения в смеси бута-нола, аммиака и воды (6 : 1 : 2). Гормоны элюировали 0.1 М фосфатным буфером (рН 7.4).
Содержание О-глюкозидов оценивали по разнице иммунореактивности до и после обработки водного остатка образца в-глюкозидазой (1 мг фермента фирмы "Sigma" (США) на 1 мг образца) при рН 5. Смесь инкубировали в термостате при 37°С в течение четырех часов. Фермент инакти-вировали добавлением этилового спирта, отделя-
ли центрифугированием, спирт выпаривали. Цитокинины определяли в водном остатке с помощью иммуноферментного анализа после их разделения при помощи ТСХ [18].
На рисунках представлены средние значения и ошибка средней из трех опытов, каждый из которых был проведен в трех биологических повтор-ностях (десять изолированных листьев, находящихся в одном сосуде).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Срезанные листья уже через 5 дней имели более низкий уровень хлорофилла по сравнению с интактными растениями, в то время как нитрат аммония замедлял снижение его содержания (рис. 1). Срезанные листья, подвергнутые обработке раствором нитрата аммония, содержали больше зеатина по сравнению с листьями, обработанными водой.
Динамика содержания гормонов в изолированных листьях представлена на рис. 2. Сразу после изоляции листа содержание зеатина в нем резко снижалось и после временного повышения на третьи сутки в дальнейшем опускалось до очень низкого уровня (рис. 2а). Содержание этого гормона в листьях, которые были обработаны раствором нитрата аммония, снижалось в течение первых двух дней после изоляции листа, а затем увеличивалось и оставалось высоким до конца эксперимента. При этом уменьшение содержания нуклеотида зеатина (ЗН) (рис. 26) через день после изоляции листа проявлялось в большей мере по сравнению с зеатином (З) и его рибозидом (ЗР) (рис. 2а и 2в) в обработанных нитратом аммония листьях, в то время как в контрольных содержание всех изученных нами производных зеатина резко снижалось к концу первых суток изоляции листьев.
Что касается динамики О-глюкозилирован-ных производных зеатина и общей суммарной концентрации свободных гормонов (З + ЗР + ЗН) в обработанных водой изолированных листьях, то мы обнаружили, что первоначальное многократное снижение содержания цитокининов в течение первых двух дней после изоляции листа совпадало с накоплением О-глюкозилированных цитокининов, в то время как временное повышение их концентрации к третьему дню сопровождалось резким снижением содержания О-глюко-зидов (рис. 3а). К пятому дню эксперимента содержание всех форм цитокининов было очень низким. Обработка нитратом аммония приводила сначала к некоторому снижению, а затем к повышению содержания как З и ЗР, так и О-глюкозидов. Из рис. 4 видно, что к концу эксперимента содержание изопентениладенозина в изолированных листьях повышалось по сравнению с
1
2
180 3 160
§ 140' 120
си
со « § &100 ^ЗеЗ 80
60 40 20 0
& й
« ч
5 ° О к
о И & ы
«
и о
О
л
к
о к к н к Я ^ Й
гЯ ° и Ю
К &
70 60 50 40 30 20 10 0
250 200 150 100 50 0
- (а) I 2
лч - \\ \\ \ \г - 4 5ч \ > - \ 5 „ А/ \ /X х ' / 4
1 \ 1 о---о 1111
; (б) 2
* / --о X 1
------ о---О 1 1 1 У 1
1- 2
(в)
Ч Ч. N \ /
Ч \ Ч \ г»---^ -----^-6-—- 1 --о
л
8 л £
О &
о
я о к к к к м о н к а о к к
се *
&
о и о О
700 600 500 400 300 200 100 0
1000 800 600 400 200 0
0 1 2 3 (б)
45
0 1 2 3 4 5 Дни после изоляции листьев
1 2 3 4 5 Дни после изоляции листьев
Рис. 2. Содержание зеатина (а), нуклеотида зеатина (б) и рибозида зеатина (в) в изолированных листьях пшеницы.
После изоляции листья четыре раза в день смачивали водой (контроль) (1) или 20 мМ раствором нитрата аммония (2).
контролем, но оно было значительно ниже, чем содержание зеатина на протяжении всего наблюдения. Ход кривой динамики содержания изопен-тениладенозина не повторял динамику содержания 3, но так же, как и у ЗН, его содержание было максимальным на пятые сутки изоляции листьев пшеницы.
ОБСУЖДЕНИЕ
В качестве индикатора старения листьев очень часто используют скорость распада в них хлорофилла. В то же время из литературных источников хорошо известны факты влияния цитокини-нов на накопление фотосинтетических пигментов и белков тилакоидных мембран хлоропластов, а также способность экзогенных цитокининов замедлять старение листьев [2, 11]. Обнаружено также, что нитраты способны повышать уровень цитокининов в растениях [8, 13]. Изучая концентрацию эндогенных цитокининов и хлорофилла в
Рис. 3. Содержание неглюкозилированных (3, ЗР, ЗН) и
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.