= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ -
УДК 579.22+612.112
ВЛИЯНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ АУТОРЕГУЛЯТОРНЫХ МОЛЕКУЛ (ГОМОСЕРИНЛАКТОНОВ И АЛКИЛОКСИБЕНЗОЛОВ) НА ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ КЛЕТОЧНЫХ ЭФФЕКТОРОВ
ЕСТЕСТВЕННОГО ИММУНИТЕТА © 2013 г. Д. Г. Дерябин*, 1, Т. Г. Свиридова*, Г. И. Эль-Регистан**, В. А. Черешнев***
* Оренбургский государственный университет ** Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва *** Институт экологии и генетики микроорганизмов РАН, Пермь Поступила в редакцию 18.06.2012 г.
Изучено влияние бактериальных ауторегуляторов из групп гомосеринлактонов (ГСЛ) и алкилокси-бензолов (АОБ), которые обнаруживаются в биологических жидкостях человека в пико- и микромолярных концентрациях, на окислительный метаболизм нейтрофилов. Действие ГСЛ и АОБ определяли в тесте индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции нейтрофилов периферической крови человека. В тесте нейтрофилы предварительно инкубировали с химическими аналогами бактериальных ауторегуляторов, которые различались в каждой группе длиной углеводородного радикала: ГСЛ • НС1, С6- и С12-ГСЛ и С1-, С6-, С12-АОБ. Выявлен эффект подавления активированной хемилюминесценции и, следовательно подавления окислительного метаболизма нейтрофилов, который был в наибольшей степени выражен при использовании ГСЛ, нежели АОБ, а внутри этих групп — возрастал с увеличением длины углеводородной цепи их гомологов. Действие высоких концентраций длинноцепоченных ауторегуляторов обоих типов связано с развитием цитотоксического эффекта, при воздействии С12-ГСЛ идущего по пути апоптоза, а в случае С12-АОБ обусловленного повреждением клеточных мембран. Действие низких концентраций ГСЛ и АОБ опосредовано их белок-модифицирующими свойствами, вызывающими изменения активности окислительных ферментов нейтрофилов и, в меньшей степени, действием ГСЛ и АОБ как про- или антиоксидантов соответственно. Полученные результаты позволяют рассматривать эффекты ГСЛ и АОБ в качестве нового механизма регуляции активности клеточных эффекторов естественного врожденного иммунитета, опосредованного бимодальностью ГСЛ и АОБ в симбиотико-паразитарных системах в зависимости от их структуры и концентраций.
Ключевые слова: гомосеринлактоны, алкилоксибензолы, нейтрофилы, фагоцитоз, активные формы кислорода, хемилюминесценция.
DOI: 10.7868/S0026365613020043
Малые ауторегуляторные молекулы и формируемые ими сети межклеточной коммуникации контролируют многие события в циклах развития микробных популяций и, в частности, процессы функциональной и структурной дифференцировки клеток [1]. Например, у грамотрицательных про-теобактерий важным классом ауторегуляторов являются гомосеринлактоны (ГСЛ), вызывающие плотностно-зависимую индукцию генов биолюминесценции, антибиотикопродукции, вирулентности, а также формирование биопленок [2, 3]. Другой известной группой ауторегуляторных молекул являются обнаруженные у представителей родов Azotobacter, Pseudomonas, Micrococcus и др. алки-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: dgderyabin@yandex.ru).
локсибензолы (АОБ) [4], выполняющие функции адаптогенов и индукторов перехода в гипомета-болическое и анабиотическое (покоящееся) состояние [5]. При этом между ГСЛ и АОБ обнаруживается определенное структурное сходство (рис. 1): оба они имеют полярное лактонное или резорциновое кольцо, соединенное с различным по длине неполярным углеводородным радикалом [4, 5], что в совокупности определяет амфи-фильные свойства этих молекул.
Особенности молекулярной организации ГСЛ и АОБ обусловливают их участие не только во внутривидовой и межвидовой коммуникации микроорганизмов, но и в их вероятном биоинформационном взаимодействии с высшими организмами [6]. В качестве важных дополнительных условий для
147
2*
(а)
O
Г~Л x и
NH-C-(CH2) -CH3
O
(б)
HO
<^)^(CH2)F CH3 HO
Рис. 1. Структурные формулы использованных гомологов ГСЛ (а) и АОБ (б), где n = 0; 4 или 10; m = 0; 5 или 11. Примечания: х — связь в молекуле ГСЛ • HCl отсутствует; y — углеводородная цепь в молекуле С6-АОБ находится в 4-пара-положении.
этого могут быть названы: образование ауторегу-ляторов многими представителями симбионтной и патогенной микрофлоры, их видонеспецифич-ность и полимодальность, а также отмеченные выше амфифильные свойства [1—5], определяющие возможность свободной транслокации ГСЛ и АОБ во внутренней среде организма человека и животных. Подтверждением сказанного является обнаружение ряда гомологов ГСЛ в слюне и легочной ткани больных цистозным фиброзом в нано-, пико- и фемтомолярных концентрациях [7, 8], а АОБ и продуктов их метаболизма в плазме крови, моче и жировой ткани человека в микро- и нано-молярных концентрациях [9, 10].
Исследование биологических эффектов ГСЛ и АОБ в указанных гетерологичных системах позволило констатировать у них ряд иммуномодули-рующих активностей [4, 11—15]. В частности, для наиболее полно охарактеризованного ауторегуля-тора P. aeruginosa, М-(3-оксододеканоил)-Ь-го-мосеринлактона, показана целая совокупность эффектов в отношении клеточных механизмов адаптивного и врожденного иммунитета, определяемых подавлением пролиферации и дифферен-цировки лимфоцитов [11], а также изменением функциональной активности нейтрофилов [12] и макрофагов [13]. В свою очередь, известные эффекты АОБ преимущественно связаны с модификацией молекулярных факторов иммунитета, таких как изменение характеристик активности бактериолитического фермента лизоцима и блокирование специфического взаимодействия в системе "антиген—антитело" [4, 14, 15].
Изложенное определяет целесообразность проведения сравнительных исследований иммуномо-дулирующих свойств ГСЛ и АОБ, в том числе, выявления зависимости эффектов этих ауторегулято-ров от особенностей их строения и действующих концентраций.
Целью настоящей работы было исследовать влияние представительного ряда гомологов бактериальных ауторегуляторов из групп гомосерин-лактонов и алкилоксибензолов на окислительный метаболизм нейтрофилов периферической крови человека, который является ключевой бактерицидной системой этих эффекторов естественного врожденного иммунитета [16].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В исследованиях использовали химические аналоги микробных ауторегуляторов — ГСЛ и АОБ, со
степенью очистки 99.9%, различающиеся длиной углеводородных радикалов (рис. 1). Гомологи ГСЛ были представлены коммерческими препаратами: L-гомосеринлактона гидрохлоридом ("Sigma", США), в дальнейшем обозначаемым как (ГСЛ • HCl); N-гексаноил-DL-гомосерин-лактоном (С6-ГСЛ) и N-додеканоил-DL-гомо-серинлактоном (С12-ГСЛ) ("Fluka", Германия). Ряд гомологов АОБ включал: метилоксибензол (С1-АОБ) и гексилоксибензол (С6-АОБ) ("Sigma", США), а также синтезированный ("Enamine", Украина) додецилоксибензол (С12-АОБ). Непосредственно перед проведением экспериментов готовили серии водных растворов исследуемых веществ (в случае С6- и С12- ГСЛ и С12-АОБ в 5% этаноле) с концентрациями 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 и 10-8 М, которые соответствовали концентрациям ГСЛ и АОБ, ранее определенным в биологических жидкостях человека и животных [7—10].
Нейтрофилы периферической крови человека
выделяли при центрифугировании в двойном градиенте "фиколл : верографин" с плотностями 1.077 г/см3 и 1.092 г/см3, собирали из интерфазы, отмывали холодным физиологическим раствором и ресуспендировали в среде 199 [17] в объеме, равном объему забранной плазмы, до концентрации 7 х 106/мл.
Интегральную оценку влияния ГСЛ и АОБ на окислительный метаболизм нейтрофилов при фагоцитозе оценивали в тесте активированной хеми-люминесценции [18], где интенсивность свечения, возникающего при окислении вносимого в систему индуктора (люминола), является количественным показателем образования активных форм кислорода. Полученную суспензию нейтро-филов в объеме 900 мкл помещали в кварцевые кюветы, куда в опытных вариантах дополнительно вносили по 100 мкл растворов исследуемых соединений ГСЛ или АОБ, а в контрольных — 100 мкл дистиллированной воды или 5% раствора этанола. Смеси инкубировали при 37°С в течение 60 мин, после чего в опытную и контрольную кюветы вносили по 20 мкл 0.015 М раствора люминола ("Sigma", США). Затем с использованием двухканаль-ного биохемилюминометра БЛМ8802М2К (СКТБ
Таблица 1. Интенсивность индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции нейтрофилов после их предварительной инкубации с ауторегуляторами ГСЛ и АОБ (в % от контроля)
Используемые концентрации ауторе-гуляторных факторов,М Ауторегуляторные факторы
ГСЛ ■ НС1 С6-ГСЛ С12-ГСЛ С1-АОБ С6-АОБ С12-АОБ
10-9 46.09** ± 2.86 28.67** ± 1.83 18.61*** ± 0.93 88.49 ± 6.46 85.97 ± 6.02 55.18* ± 3.31
10-8 38.20** ± 2.67 29.29** ± 1.9 16.71*** ± 0.89 84.89 ± 5.86 78.54 ± 5.81 51.87* ± 5.03
10-7 30.54** ± 2.05 23.10** ± 1.5 13.69*** ± 0.73 62.46* ± 4.31 66.61 ± 4.46 48.75** ± 3.41
10-6 29.86** ± 2.00 11.73*** ± 0.59 5.65*** ± 0.29 61.35* ± 4.23 60.54* ± 4.48 33.05** ± 2.31
10-5 22.59** ± 1.47 7.66** ± 0.49 5.32*** ± 0.28 60.09* ± 4.03 50.76** ± 3.76 29.40** ± 1.19
Обозначения: * P < 0.05; ** P < 0.01; *** P < 0.001 по отношению к контролю.
"Наука", Россия) в течение 100 с измеряли фоновое свечение клеточных суспензий. Фагоцитарную реакцию запускали одновременным внесением в опытную и контрольную пробы по 100 мкл взвесей предварительно термоинактивированных и опсонизированных сывороткой крови клеток Staphylococcus aureus FDA 209P с концентрацией 109 КОЕ/мл. Люминолзависимую хемилюминес-ценцию (ЛЗХЛ) регистрировали в течение 15 мин при кратности усиления сигнала х50, после чего вычисляли соотношение максимальной интенсивности ЛЗХЛ в опытной к контрольной пробах, вычитая значения фонового свечения.
Цитотоксичность ГСЛ и АОБ в отношении нейтрофилов оценивали в тесте с красителем три-пановым синим (ТС). Для этого суспензию клеток, предварительно инкубированных с различными концентрациями ауторегуляторов при 37°С в течение 60 мин, в равных объемах смешивали с 0.1% раствором красителя в 0.85% NaCl, выдерживали в течение 15 мин и переносили в камеру Горяева. Подсчет проводили в двадцати пяти больших квадратах, отмечая погибшие, голубые (ТС+), и живые,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.