ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2008, том 44, № 1, с. 101-105
УДК 577.152.14.042
ВЛИЯНИЕ БЕЛКОВ-ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕИНАЗ ИЗ КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ НА РОСТ И РАЗВИТИЕ ФИТОПАТОГЕННЫХ
МИКРООРГАНИЗМОВ
© 2008 г. Т. А. Ревина, Н. Г. Герасимова, Г. В. Кладницкая, Г. И. Чаленко, Т. А. Валуева
Институт биохимии им. АН. Баха РАН, Москва 119071 e-mail: valueva@inbi.ras.ru Поступила в редакцию 30.05.2006 г.
Изучали действие двух белков PSPI-21 и PKSI на рост и развитие фитопатогенных микроорганизмов, оомицета Phytophthora infestans и гриба Fusarium culmorum. Оба белка были выделены из клубней картофеля (Solanum tuberosum L., сорт Истринский) и охарактеризованы как ингибиторы сери-новых протеиназ. Показано, что они с различной степенью эффективности угнетали рост как оомицета P. infestans, так и гриба F. culmorum, при этом белок PSPI-21 эффективнее действовал на рост мицелия оомицета, а PKSI - гриба. Оказалось, что оба белка вызывали полное разрушение зооспор оомицета, и лишь частичное - макроконидий гриба. Высказано предположение об участии этих белков в защите растения картофеля при его поражении фитопатогенными микроорганизмами.
Картофель относится к культурам, которые сильно подвержены болезням. В значительной степени это обусловлено особенностями биологии этих растений. Богатые водой и углеводами клубни представляют собой благоприятную среду для развития возбудителей различных заболеваний. Фитопатогенные грибы составляют основную, наиболее распространенную и вредоносную группу возбудителей болезней картофеля. Среди них наиболее распространены фитофтороз и фузари-оз, которые вызываются оомицетом Phytophtora infestans (Mont.) de Bary и грибом Fusarium culmorum (W. G. Sm.) Sacc, соответственно. Известно, что заболевание фитофторозом приводит к ограничению ассимиляционной деятельности растений в наиболее ответственный период формирования клубней, а также к гниению картофеля во время хранения. Фузариоз вызывает засыхание и преждевременное отмирание стеблей до и после периода образования клубней, а также гниение картофеля во время хранения [1].
Показано, что при контакте с растением фито-патогенные микроорганизмы продуцируют гидролазы, вызывающие разрушение пектин-белковых комплексов растительной клеточной стенки, среди которых присутствуют активные экстрацеллю-лярные протеиназы [2]. В предыдущих работах [3, 4] было показано, что при выращивании на среде, содержащей термостабильные белки из клубней картофеля (Solanum tuberosum L., сорт Истринский) оомицет P. infestans и гриб F. culmorum продуцируют комплексы экстрацеллюлярных серино-вых протеиназ с субтилизино- и трипсиноподобной специфичностью. В настоящее время получено достаточное количество данных, указывающих на
то, что протеиназы фитопатогенных микроорганизмов могут играть активную роль в патогенезе [5-7].
В процессе эволюции растения выработали защитные механизмы, которые позволяют им успешно противостоять различного рода неблагоприятным воздействиям, в том числе и действию фитопатогенных микроорганизмов. В ответ на агрессивное действие протеиназ в растении индуцируется синтез белковых ингибиторов, действие которых может быть направлено на подавление активности этих ферментов [8]. Впервые подобное явление наблюдалось у томатов, инфицированных P. infestans [9]. Было также показано, что при инфицировании клубней картофеля этим оомицетом накапливаются белки-ингибиторы се-риновых протеиназ с молекулярными массами от 20 до 25 кДа [10, 11].
В предыдущих работах [12, 13] были охарактеризованы белки-ингибиторы сериновых протеиназ, выделенные из клубней картофеля сорта Истринский. Белок-ингибитор, обозначенный как PSPI-21, молекула которого состоит из двух полипептидных цепей, соединенных дисульфидной связью, эффективно подавляет активность эластазы из лейкоцитов человека, но слабее действует на трипсин и хи-мотрипсин [12]. Белок, обозначенный как PKSI, проявляет себя как специфический ингибитор суб-тилизина Карлсберг [13]. Оба ингибитора являются членами подсемейства картофельных ингибиторов протеиназ типа Кунитца (potato Kunitz-type proteinase inhibitors, PKPIs) [14]. Среди ингибиторов, накапливающихся в клубнях картофеля при инфицировании P. infestans, был обнаружен белок PSPI-21 [11].
102
РЕВИНА и др.
кДа — 94
— 20.1
— 14.4
12 3
Рис. 1. ДДС-ПААГ-электрофорез белков, выделенных из клубней картофеля: 1 - белок PSPI-21, 2 - белок PKSI, 3 - белки-маркеры (кДа): фосфорилаза b (94), бычий сывороточный альбумин (67), яичный альбумин (43), карбоангидраза (30), ингибитор Ку-нитца из сои (20.1), лактальбумин (14.4).
В связи с этим представляет интерес изучение влияния ингибиторов сериновых протеиназ из клубней картофеля на рост и развитие P. infestans и F. culmorum. Результаты этих исследований позволят подойти к пониманию механизма защитного действия этих ингибиторов в ответ на поражение растения картофеля фитопатогенными микроорганизмами.
Цель работы - изучить влияние белков PSPI-21 и PKSI на рост гиф и развитие зооспор оомицета P. infestans и макроконидий гриба F. culmorum.
МЕТОДИКА
В работе использовали оомицет P. infestans (Mont.) de Bary, выращенный на овсяно-агаровой среде с добавлением термостабильных белков картофеля в течение 11 сут при 20°C. Для получения суспензии зооспор оомицета пробирку с 11-суточ-ной культурой заливали дистиллированной водой и выдерживали в течение 1ч при 4°C, а затем 45 мин при комнатной температуре, что обеспечивало высокий процент выхода зооспор. В опытах использовали суспензию плотностью 2 х 105 зооспор/мл.
Суспензию макроконидий гриба F. culmorum получали, смывая их с поверхности 14-суточного мицелия, выросшего при 25°C на овсяно-агаровой
среде с добавлением термостабильных белков картофеля. Для индуцирования массового выхода макроконидий суспензию выдерживали в дистиллированной воде в течение 1 ч на холоде и 30 мин при комнатной температуре. В опытах использовали суспензию плотностью 2 х 105 макроконидий/мл.
Белки PSPI-21 и PKSI выделяли из клубней картофеля (S. tuberosum L., сорт Истринский), используя методы гель-хроматографии на Сефа-дексе G-75 ("Farmacia", Швеция) и ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе и КМ-сефа-розе CL 6B ("Serva", Германия), как описано ранее в работах [12, 13].
К суспензии зооспор или макроконидий добавляли раствор белка, концентрацию которого варьировали от 0.2 до 2 мг/мл в соотношении 1 : 1 (от 5 до 50 мкмоль в пробе). Затем 0.1 мл смеси наносили на предметное стекло, накрывали покровным стеклом и инкубировали в течение 18 ч при 22°C. Количество проросших и разрушенных зооспор (или макроконидий) и длину гиф, образующихся при их прорастании, определяли в трехкратной по-вторности для каждой концентрации белка на микроскопе Laboral (Германия) при увеличении х120. В качестве контроля использовали суспензию зооспор (или макроконидий) без добавления белков.
Диск-электрофорез в присутствии ДДС-Na и ß-меркаптоэтанола ("Serva", Германия) проводили в 20%-ном полиакриламидном геле (ДДС-Na-ПААГ) ("Serva", Германия) по методу Лэммли [15]. Гели окрашивали 0.1%-ным раствором Ку-масси R-250 ("Serva", Германия) в 25%-ном растворе этанола, содержащем 5% формальдегида. Использовали набор маркеров (LMW Calibration Kit) фирмы "Pharmacia" (Швеция).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Из здоровых клубней картофеля были выделены и очищены с помощью методов ионообменной хроматографии два белковых препарата. По данным ДДС-№-ПААГ-электрофореза, приведенным на рис. 1, выделенные препараты содержали гомогенные белки PSPI-21 (дорожка 1) и PKSI (дорожка 2), описанные ранее в работах [12, 13]. Видно, что PSPI-21 состоит из двух полипептидных цепей с молекулярными массами 16.5 и 4.5 кДа, которые соединяются дисульфидной связью, разрушающейся при действии ß-меркапто-этанола. Белок PKSI состоит из одной полипептидной цепи и имеет молекулярную массу 21 кДа.
На рис. 2а приведены результаты изучения влияния белков PSPI-21 и PKSI на прорастание гиф оомицета P. infestans (Mont.) de Bary. Видно, что оба белка существенно подавляли рост гиф оомицета. Так, при добавлении к суспензии зооспор 9.5 мкмоль белка PSPI-21 длина прорастающих гиф уменьшалась на 50% по сравнению с
--
(а) (б)
Число поврежденных Длина гиф, % от контроля зооспор, % от контроля
100
80 -
60 40
20 -
5 10 15 20 25 30 мкмоль
10 20 30 40 50 60 мкмоль
Рис. 2. Влияние белков-ингибиторов из клубней картофеля на мицелий (а) и зооспоры (•) оомицета P. infestans: 1 - белок PSPI-21, 2 - белок PKSI; представлены средние значения трех независимых экспериментов со стандартной ошибкой от 2 до 10%.
контролем, а при добавлении 23 мкмоль обнаруживалось практически полное подавление их прорастания. В то же время для снижения роста гиф на 50% требовалось практически в два раза большее количество PKSI (17 мкмоль) и только добавление 30 мкмоль белка приводило к полному подавлению их прорастания.
Как показано на рис. 26, при добавлении к суспензии зооспор оомицета 23 мкмоль белка PSPI-21 практически все они оказывались поврежденными. В то же время белок PKSI действовал слабее,
и даже при более высоком его содержании (выше 30 мкмоль) повреждению подвергалась только часть зооспор (примерно 60%). Полное отсутствие неповрежденных клеток наблюдали при добавлении к суспензии 47 мкмоль белка. Таким образом, белок PSPI-21 оказывал более эффективное действие на рост мицелия и состояние зооспор ооми-цета P. infestans, чем PKSI.
Другой характер действия наблюдали при добавлении белков PSPI-21 и PKSI к суспензии макроконидий гриба F. culmorum (рис. 3). Видно, что, хотя добавление 16 мкмоль белка PKSI снижало рост гиф гриба на 50%, но даже в присутствии более 48 мкмоль не удавалось достичь полного подавления их роста (рис. 3а). Еще менее эффективно белок PKSI влиял на клетки гриба. Более 50% макроконидий оказывались неповрежденными при инкубации их суспензии в присутствии более 48 мкмоль белка (рис. 36). Эти данные свидетельствовали о том, что белок PKSI, который, как показано выше, заметно тормозил рост и развитие оомицета P. infestans, значительно менее активен по отношению к грибу
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.