НЕЙРОХИМИЯ, 2007, том 24, № 1, с. 30-36
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.121.7; 616.831:616-092.9
ВЛИЯНИЕ БЕТА-АМИЛОИДНЫХ ПЕПТИДОВ НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ ОБМЕНА ПЕРЕКИСИ ВОДОРОДА
В МОЗГЕ КРЫСЫ
© 2007 г. Ю. Г. Каминский1' 2*, И. Н. Соломадин3, Н. В. Маров3, Е. А. Косенко2
1 Институт биологического приборостроения РАН, Пущино, Россия 2 Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино, Россия 3 Пензенский государственный педагогический университет, Пенза, Россия
Исследовали действие бета-амилоидных (AP) пептидов на митохондриальные и немитохондриаль-ные ферментные источники активных кислородных метаболитов и антиокислительные ферменты в мозге крыс. Вводимые в IV желудочек мозга Ap25_35 и Ар1-40 стимулировали образование Н202 в митохондриях неокортекса лишь тогда, когда они находились в агрегированной форме. Хроническое введение агрегированного Ар1-40 приводило также к повышению активности Н202-генериру-ющей Mn-супероксиддисмутазы, снижению активности Н202-потребляющих ферментов каталазы и глутатионпероксидазы и концентрации неферментного антиоксиданта GSH в митохондриях неокортекса. Ар1-40 повышал активность Си^п-СОД и альдегидоксидазы, способствовал превращению ксантиндегидрогеназы в ксантиноксидазу и соответствующему ускорению образования H2O2 в цитозоле.
Ключевые слова: Afi-пептиды, перекись водорода, ферменты-антиоксиданты, ксантиноксидаза, моноаминоксидаза, митохондрии мозга.
Сокращения: БА - болезнь Альцгеймера; Ар -бета-амилоид; АРР - белок-предшественник бета-амилоидов; СОД - супероксиддисмутаза; МАО - моноаминоксидаза; КО - ксантиноксидаза; КДГ - ксантиндегидрогеназа; АКМ - активные кислородные метаболиты; ФМСФ - фенил-метилсульфонилфторид.
ВВЕДЕНИЕ
Бета-амилоидные (Ав) пептиды - это протео-литические продукты белка-предшественника амилоидов (АРР) [1, 2] и главные компоненты внеклеточных амилоидных отложений, известных как сенильные бляшки, инициирующие медленную дегенерацию нейронов мозга при болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных заболеваниях.
Одно из представлений о причине гибели нейронов, вызываемой Ав-пептидами, основано на образовании проницаемых для Са2+ пор в клеточной мембране нейрона, способствующих избыточному втоку Са2+ и индукции нейротоксических каскадов [3]. При действии Ав-пептидов опосредованное ионами Са2+ усиление генерации активных кислородных метаболитов (АКМ) превышает защитную способность клеток и таким спосо-
* Адресат для корреспонденции: 142290, Пущино, ул. Институтская, д. 5; факс: (27) 330553; e-mail: kaminsky@iteb.ru
бом ведет к клеточной гибели [4]. Вероятно, кальций, входящий в нейрон, поглощается митохондриями и вызывает деполяризацию внутренней митохондриальной мембраны. Это приводит к изменению функций митохондриальной дыхательной цепи и усиленному образованию супероксидного радикала (O2) [5]. Затем O- используется
Мп2+-супероксиддисмутазой (Mn-СОД) для образования перекиси водорода (H2O2) в митохондриаль-ном матриксе. H2O2 может также генерироваться в реакции, катализируемой моноаминоксидазой В (MAO В) - ферментом, локализованным во внешней митохондриальной мембране [6]. Источниками H2O2 в цитоплазме нейрона могут быть ксантиноксидаза (КО), альдегидоксидаза и Си^п-СОД.
Таким образом, имеется ряд митохондриаль-ных и немитохондриальных источников, которые могут генерировать АКМ в мозге. Однако пока не определено, вовлекаются ли вышеупомянутые ферменты в окислительный стресс и цитотоксич-ность Aß-пептидов. Неизвестен также вклад каждого ферментного источника в генерацию АКМ при нейродегенеративной патологии, в частности при болезни Альцгеймера.
Целью этой работы было изучить действие Aß-пептидов на митохондриальные и немитохон-дриальные ферментные источники АКМ и антиокислительные ферменты в мозге крыс.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Животные. В экспериментах использовали самцов крыс Вистар массой 200-250 г. В опытах использовали коммерческие препараты Aß25-35 или Aß1-40, которые вводили в мозг животным в неагрегированном или предварительно агрегированном виде непрерывно в течение различных интервалов времени (до 14 дней), как это описано ранее [7]. Канюлю, соединенную с мини-насосом, имплантировали в IV желудочек мозга, и через
4 дня начинали введение 15 мкл 0.9%-ного раствора NaCl, содержащего Aß-пептид в суммарной дозе
5 мкг на 1 кг массы тела. Доза Aß-пептида рассчитана как его количество, получаемое животным после введения за 14 дней (т.е. она оказывалась пропорционально меньшей, если период введения раствора был короче 14 сут) [расчеты дозы Aß-пептида: около 360 нг/день на 1 кг массы тела, либо 70-90 нг/день на животное (на желудочек мозга), или 15 нг/ч на 1 кг, или 3-3.7 нг/час на животное (на желудочек мозга)]. Ложноопериро-ванным животным вводили 0.9% раствор NaCl, и они были использованы в качестве контроля. Забивали крыс декапитацией.
Материалы. Бензиламин, ß-фенилэтиламин, терт-бутилгидропероксид, аллопурин, NAD, NADPH, ЭДTA, ЭПА, р-нитротетразолиевый синий, метиленовый синий, ксантин, ксантинокси-даза, пероксидаза из хрена, DL-дитиотреитол, GSH, GSSG, скополетин, птерин, изоксантопте-рин, антимицин A, цианид калия, феррицианид калия, азид натрия, фенилметилсульфонилфто-рид (îMCî), Aß25-35 и Aß1-40 получены из Sigma Chemical Co., OTA; сахароза, Tris и Mops — из Serva, Германия; ^фадекс Г-25 (с размером частиц 10-40 мкм) - из Bio-Rad Lab., CMA; меркаптосук-цинат калия и Тритон X-100 из Fluka, Швейцария; фиколл - из Pharmacia, Uppsala, Швеция; тиофла-вин Т - из Molecular Probes, Eugene, C^MA.
Для получения агрегированной формы Aß-пеп-тиды растворяли (до конечной концентрации 1 мг/мл) в стерильном 0.1 M фосфатном буфере, pH 7.4, и инкубировали от 10 мин до 5 дней при 37°C и постоянном перемешивании с помощью шейкера. Такая процедура приводила к образованию амилоидных волокон. Об агрегации Aß-пеп-тидов судили по флуоресценции тиофлавина Т, добавляемого в оптическую кювету, при 482 нм [8, 9]. Флуоресценцию тиофлавина Т регистрировали с помощью флуориметра SFM-25 (Kontron Instrument, Korea) при длине волны возбуждающего света 360 нм. Aгpегаты не отделяли от свободного амилоида.
Выделение цитоплазматической фракции и митохондрий мозга. Неокортекс гомогенизировали в 9 объемах среды (0.25 M сахароза, 0.5 hM ЭДTA и 10 mM Tris, pH 7.4). Mитоxондpиальнyю и цитоплазматическую фракции выделяли мето-
дом дифференциального центрифугирования, как описано ранее [10]. Несинаптические митохондрии выделяли из общей митохондриальной фракции центрифугированием в градиенте плотности фиколла [11].
Определение перекиси водорода. Образование H2O2 в выделенных митохондриях регистрировали непрерывно по флуоресценции скополетина в присутствии пероксидазы описанным ранее методом [12], добавляя в инкубационную смесь NaN3 (ингибитор каталазы) и меркаптосукцинат калия (ингибитор глутатионпероксидазы). Митохондрии (0.5 мг/мл) добавляли в среду, содержащую 0.25 M сахарозу, 10 мМ KCl, 10 мМ MOPS, pH 7.3, 0.5 мМ ЭГТА, 5 мМ сукцинат калия, 2 мкМ антимицин А, 50 мкМ NaN3, 50 мкМ меркаптосукцинат калия и 0.25 мкМ скополетин. Реакцию запускали добавлением пероксидазы (6 ед/мл). В конце реакции добавляли H2O2 (в конечной концентрации 0.5-1.0 мкМ) в качестве стандарта. Измерения проводили в пробах объемом 1 мл при 25°C. Стандартный раствор H2O2 готовили ежедневно путем разбавления 30%-ной H2O2. Концентрацию H2O2 рассчитывали по абсорбции при 240 нм и £ 39.4 М-1 см-1 [13].
Определение активности ферментов. Активность ксантиндегидрогеназы (КДГ), Н2О2-образую-щих моноаминоксидазы (МАО) и ксантиноксидазы
(КО), O2 -генерирующей альдегидоксидазы, фер-ментов-антиоксидантов каталазы, супероксиддис-мутазы (СОД, общей активности), Си^п-СОД, Мп-СОД, глутатионпероксидазы и глутатионре-дуктазы измеряли в цитоплазматической фракции и несинаптических митохондриях неокортек-са контрольных крыс и крыс, которым вводили Aß-пептиды. Протокол измерения активности указанных ферментов спектрофотометрически-ми или флуориметрическими методами описан в предыдущей статье [14].
Измерение GSH. Для измерения GSH митохондрии разрушали осмотическим шоком в 10 мМ KCl и тремя циклами замораживания (в среде жидкого азота) - размораживания. Затем суспензию центрифугировали (15800g, 5 мин), белок супер-натанта удаляли после обработки 10%-ной суль-фосалициловой кислотой и повторного центрифугирования, а конечный супернатант использовали для определения GSH флуориметрическим методом по скорости образования 5-тио-2-нитро-бензоата при окислении GSH 5,5'-дитиобис(2-нит-робензоатом) [15].
Статистическая обработка. Результаты выражали как среднее значение ± стандартное отклонение. Различия между группами анализировали методом ANOVA с последующим i-тестом Стью-дента для определения статистической значимости с помощью компьютерной программы Prizm 4.0. Сравнение между двумя экспериментальны-
Скорость образования H2O2 нмоль/мин на 1 мг белка
Скорость образования H2O2 нмоль/мин на 1 мг белка
01234567 14
Дни после начала введения Ар-пептида
Рис. 1. Влияние коммерческих AP25_35 и APj^q in vivo на образование Н2О2 в несинаптических митохондриях неокортекса крысы.
Крысам в мозг вводили с постоянной скоростью коммерческий A^25_35 или APi_4q в общей дозе 5 мкг/кг (в расчете на 14 дней). Через 1-14 дней животных дека-питировали, выделяли митохондрии из неокортекса и анализировали их на способность к образованию Н2О2. В контроле скорость образования Н2О2 была 0.26 ± 0.02 нмоль/мин на 1 мг белка (эти значения ограничены двумя горизонтальными линиями). Кривая 1 - A^25-35; кривая 2 - AP!^. Приведены средние значения и стандартные отклонения для n = 3. *Достоверное отличие от контроля, P < 0.05.
ми группами основывалось на двустороннем ¿-критерии. P < 0.05 рассматривали как статистически значимое.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
лр25-35, но не Ab1-40 ускоряет продукцию перекиси водорода в митохондриях мозга. Скорость образования H2O2 в митохондриях мозга крыс, которым вводили коммерческий препарат А^25-35, повышалась во времени от 0.286 нмоль/мин на 1 мг белка к 1 дню до 0.328 нмоль/мин на 1 мг белка (на 26%, P =
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.