научная статья по теме ВЛИЯНИЕ БРАССИНОЛИДА НА ТИРОЗИНОВОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ ЛИСТЬЕВ ГОРОХА Химия

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ БРАССИНОЛИДА НА ТИРОЗИНОВОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ ЛИСТЬЕВ ГОРОХА»

БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 4, с. 525 - 532

УДК 581.1

ВЛИЯНИЕ БРАССИНОЛИДА НА ТИРОЗИНОВОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ ЛИСТЬЕВ ГОРОХА

© 2006 г. Е.О. Федина*, Ф.Г. Каримова, И.А. Тарчевский

Казанский институт биохимии и биофизики, КазНЦРАН, 420111 Казань, ул. Лобачевского, 2/31; факс: (07-843)292-7347, электронная почта: fedina@mail.knc.ru

Поступила в редакцию 20.06.05 После доработки 29.09.05

Исследовано брассиностероид-индуцируемое фосфорилирование белков по тирозиновым остаткам. Белки грубого экстракта листьев гороха анализировали с помощью одномерного и двумерного электрофореза с последующим Вестерн-блот анализом с моноклональными антителами к фосфотирозиновым белкам PY20. Одномерный электрофорез позволил выявить 7, двумерный — 13 белков, фосфорилированных по тирозину. Уровень фосфорилирования большинства из них повышался под влиянием брассинолида. Использование ингибиторов тирозиновых протеинфосфатаз, фениларсиноксида и ортованадата, позволило выявить общую тенденцию их действия — повышение уровня тирозинового фосфорилирования белков.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: брассинолид, фосфорилирование белков по тирозину, Pisum sativum, тирозиновые протеинфосфатазы, тирозиновые протеинкиназы.

Брассиностероиды (БС) — гормоны растений, структурно сходные со стероидными гормонами животных [1]. Экзогенные БС вызывают повышение устойчивости растений к холоду, засолению, засухе, инфицированию патогенами. БС — важные регуляторы роста и развития растений: мутанты по биосинтезу БС и ответу на них страдают карликовостью, задержкой цветения, ухудшением плодоношения [2, 3].

В настоящее время внимание исследователей направлено на изучение молекулярных механизмов передачи сигнала от БС [4—7]. Найдены и охарактеризованы рецепторы БС [8, 9], которые могут трансфосфорилироваться по 8ег/1Ъг [10]. Показано участие в передаче БС сигнала многих белков [11—13]. Однако имеется еще очень мало информации об участии конкретных сигнальных систем в реакциях растений на действие БС. Обнаружено, что в передаче БС

Принятые сокращения: БС — брассиностероиды, БЛ — брассинолид, ФАО — фениларсиноксид, ПП — полипептиды, ТПФ — тирозиновые протеинфосфатазы, ТПК — тирозиновые протеинкиназы, МАРК — митоген-активиру-емые киназы, УТФ — удельное тирозиновое фосфорилирование белков, ХАПС — 3-[(3-холамидопропил) диметил-аммоний]-1-пропансульфонат, ДТТ — дитиотрейтол, ТЕМЕД — тетраметилэтилендиамин, ПМСФ — фенилме-тилсульфонилфторид, ПВДФ мембраны — поливинил-дифторные мембраны, ИЭФ-буфер — буфер для изоэлект-рофокусирования, ТБСТ — Тпв-буфер солевой с Твином-20. * Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.

сигнала участвуют Са2+-зависимые протеинкиназы, МАРК [14, 15], В1Ш киназа [16], а также липоксигеназный каскад [17].

Общеизвестна ключевая роль фосфорилиро-вания/дефосфорилирования белков в преобразовании и передаче информации в генетический аппарат клеток [18]. Фосфорилируются, главным образом, остатки серина, треонина, гисти-дина, аспартата и тирозина. В последнее время особое внимание привлекает тирозиновое фос-форилирование, несмотря на то, что его вклад в общее фосфорилирование белков невелик. В клетках позвоночных животных оно играет определяющую роль в регуляции роста, пролиферации, прохождении фаз клеточного цикла, интеграции цитоскелета в ответ на различные воздействия [19]. Гораздо меньше информации о роли тирозинового фосфорилирования белков у растений [20]. Имеются данные о протеинтиро-зинкиназной активности и фосфорилирован-ных по тирозину белках [21], в том числе белках цитоскелета профилина [22] и актина [23], об участии тирозинового фосфорилирования белков в ответе на действие элиситора [24], о его роли в соматическом эмбриогенезе [25, 26] и в транспорте ионов [27]. Нам не известны данные о влиянии БС на тирозиновое фосфорилирование белков. В связи с этим мы поставили задачу изучения тирозинового фосфорилирования белков растений и влияния на него брассиноли-да (БЛ).

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Растительный материал. Растения гороха (Pisum sativum L.) выращивали в условиях 10-ч фотопериода на питательной среде Хоглан-да—Арнона I в течение 9 дней. После отделения от корней побеги помещали в среду роста (контроль) или в среду с добавлением эффекторов (0,1 мкМ брассинолид, 100 мкМ ортованадат и 50 мкМ ФАО).

Приготовление образцов для анализа. Листья фиксировали в жидком азоте и гомогенизировали в среде (1 : 2), содержащей 50 мМ Tris-HCl, рН 7,5; 1 мМ ДТТ; 1 мМ ПМСФ; 10 мМ ЭДТА; 0,1 мМ ортованадат; 1 мМ теофиллин и 3% (m/V) поливинилпирролидон. Гомогенат центрифугировали в течение 10 мин при 5° и 16 000 g. Супернатант использовали сразу как для приготовления образца для одномерного (1D) электрофореза, так и для осаждения белка для двумерного (2D)-электрофореза. Приготовление образца для Ш-электрофореза проводили согласно методике Леммли [28]. Белки для 2D-электрофореза осаждали холодным 80% (m/V) ацетоном. Осажденный белок промывали 3 раза холодным ацетоном и 100 мкг белка растворяли в 150 мкл ИЭФ-буфера (8 М мочевина; 2 М тио-мочевина; 2% (m/V) ХАПС; 0,2% (V/V) амфоли-та pH 3-10; 3 мМ ДТТ и 20 мМ Tris).

Тирозиновое фосфорилирование растворимых белков листьев. Фосфорилирование белков по тирозину определяли с помощью методов одномерного или двумерного электрофореза с последующим проведением иммуноблоттинга с использованием моноклональных антител к фос-фотирозину PY 20.

Одномерный и двумерный электрофорез. 1D-электрофорез проводили согласно методике Леммли [28] в 6-20% градиенте ПААГ. Количество белка, нанесенного на трек, составляло 25 мкг. Для 2D-электрофореза полоски геля (стрипы) для изофоэлектрофокусировки с иммобилизованным градиентом pH (рН 3-10, 7 см длиной) регидратировали с образцами при 20° 12 ч в камерах для изофокусирования в следующем режиме: 15 мин при напряжении 250 В, затем напряжение линейно повышали до 4000 В в течение 2 ч, далее проводили изофокусировку образца при том же напряжении в течение 2 ч. Общее количество вольт-часов составило 24 000 при температуре 20° и силе тока 50 мкА на стрип. Затем стрипы 15 мин выдерживали в уравновешивающем буфере 1 (6 М мочевина, 2% (m/V) Ds-Na, 30% (V/V) глицерин, 50 мМ Tris-HCl, следы бромфенолового синего и 2% (m/V) ДТТ) и уравновешивающем буфере 2 (6 М мочевина, 2% Ds-Na, 30% глицерин, 50 мМ Tris-HCl,

0,005% бромфеноловый синий и 2,5% (m/V) йод-ацетамид). Оба конца стрипа (по 0,5 см) отрезали, а оставшуюся часть накладывали на 2D мини-гель (Tris-глицин, толщина 1 мм, 6—20% ПААГ). 2D-электрофорез проводили с использованием электродного буфера, содержащего 25 мМ Tris-HCl, 192 мМ глицина и 0,1% Ds-Na, при силе тока 5 мА на 1 гель в течение 20 мин, затем при 10 мА в течение 120—150 мин.

Иммуноблоттинг. Для изучения белков, фос-форилированных по тирозину, после 1D- или 2D-электрофореза белки переносили на ПВДФ мембраны в течение 90 мин при постоянной величине электрического тока 150 мА согласно стандартному протоколу, используя прибор для полусухого блотинга. Затем мембраны в течение 1 ч блокировали 1% (m/V) БСА, растворенным в ТБСТ (10 мМ Tris-HCl, рН 7,5; 10 мМ NaCl и 0,05% Твин-20) при 5°. Блоты затем инкубировали 1 ч при комнатной температуре с антителами к фосфотирозиновым белкам PY20, конъюгирован-ными с пероксидазой хрена в разведении 1 : 1000 в ТБСТ. Для визуализации тирозинового фосфо-рилирования белков блоты инкубировали 1 мин в хемилюминесцентном реагенте (ECL-реагенте) и экспонировали на рентгеновской пленке, белки мембран окрашивали 0,1% Кумасси R-250 10 мин, затем отмывали 50 % этанолом.

Анализ полученных данных. Так как действие брассинолида и ванадата на побеги было относительно непродолжительным, то за это время изменения содержания белков практически не происходило и, в связи с этим, интенсивность хемилюминесценции давала необходимую информацию об уровнях тирозинового фосфори-лирования белков. Однако при сопоставлении фосфорилирования различных индивидуальных белков необходимо было учитывать, что интенсивность хемилюминесценции (ECL) зависит от содержания белков. В связи с этим определяли величину отношения интенсивности хемилю-минесценции к содержанию того или иного белка. Для вычисления удельного тирозинового фосфорилирования белков, разделенных элект-рофоретически, мембраны, окрашенные Кумасси R-250, и радиоавтографические пленки с фосфорилированными белками сканировали с помощью Epson Perfection 3170 Photo. Сканированное изображение данных Ш-электрофореза переводили в числовые значения оптической плотности с помощью программы Image Master 1D- (Англия), а 2D-электрофореза — с помощью программы Flicker (http://open2dprot.source-forge.net/Flicker) (США). Удельное тирозиновое фосфорилирование выражали как отношение оптической плотности фосфорилированного белка (хемилюминесценции), идентифициро-

ванного на радиоавтографической пленке, к оптической плотности того же самого белка, идентифицированного на мембране, окрашенной Кумасси R-250. Величину удельного тирозино-вого фосфорилирования оценивали в относительных единицах (отн. ед.) и обозначали как УТФ.

Количественное определение белка. Количество белка измеряли согласно методу Брэдфорд [29], используя БСА в качестве стандарта.

Реактивы. В работе использованы Tris-HCl, глицин, ДТТ, ортованадат натрия, мочевина, тио-мочевина, ХАПС, йодацетамид, амфолиты, стрипы для изофокусировки, поливинилпирро-лидон, Ds-Na, ТЕМЕД, глицин, бромфеноло-вый синий, персульфат аммония, акриламид, Кумасси R-250 и G-250, а также метилен-бис-акриламид фирмы «Bio-Rad» (США). Монокло-нальные антитела к белкам, фосфорилирован-ным по тирозину (клон PY20), ПВДФ мембраны, хемилюминесцентный реагент (ECL-реагент), Твин 20 и БСА были получены в «Amersham Pharmacia Biotech» (Англия). ПМСФ, ЭДТА и теофиллин были поставлены фирмой «Sigma» (США). Использовали рентгеновскую пленку, NaCl, глицерин отечественного производства. Брассинолид был синтезирован в Институте биоорганической химии БНАН (Беларусь).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Среди полипептидов проростков гороха преобладают ПП, характеризующиеся молекулярной массой 15 и 47 кДа. С большой долей вероятности эти

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Химия»