БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 4, с. 525 - 532
УДК 581.1
ВЛИЯНИЕ БРАССИНОЛИДА НА ТИРОЗИНОВОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ ЛИСТЬЕВ ГОРОХА
© 2006 г. Е.О. Федина*, Ф.Г. Каримова, И.А. Тарчевский
Казанский институт биохимии и биофизики, КазНЦРАН, 420111 Казань, ул. Лобачевского, 2/31; факс: (07-843)292-7347, электронная почта: fedina@mail.knc.ru
Поступила в редакцию 20.06.05 После доработки 29.09.05
Исследовано брассиностероид-индуцируемое фосфорилирование белков по тирозиновым остаткам. Белки грубого экстракта листьев гороха анализировали с помощью одномерного и двумерного электрофореза с последующим Вестерн-блот анализом с моноклональными антителами к фосфотирозиновым белкам PY20. Одномерный электрофорез позволил выявить 7, двумерный — 13 белков, фосфорилированных по тирозину. Уровень фосфорилирования большинства из них повышался под влиянием брассинолида. Использование ингибиторов тирозиновых протеинфосфатаз, фениларсиноксида и ортованадата, позволило выявить общую тенденцию их действия — повышение уровня тирозинового фосфорилирования белков.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: брассинолид, фосфорилирование белков по тирозину, Pisum sativum, тирозиновые протеинфосфатазы, тирозиновые протеинкиназы.
Брассиностероиды (БС) — гормоны растений, структурно сходные со стероидными гормонами животных [1]. Экзогенные БС вызывают повышение устойчивости растений к холоду, засолению, засухе, инфицированию патогенами. БС — важные регуляторы роста и развития растений: мутанты по биосинтезу БС и ответу на них страдают карликовостью, задержкой цветения, ухудшением плодоношения [2, 3].
В настоящее время внимание исследователей направлено на изучение молекулярных механизмов передачи сигнала от БС [4—7]. Найдены и охарактеризованы рецепторы БС [8, 9], которые могут трансфосфорилироваться по 8ег/1Ъг [10]. Показано участие в передаче БС сигнала многих белков [11—13]. Однако имеется еще очень мало информации об участии конкретных сигнальных систем в реакциях растений на действие БС. Обнаружено, что в передаче БС
Принятые сокращения: БС — брассиностероиды, БЛ — брассинолид, ФАО — фениларсиноксид, ПП — полипептиды, ТПФ — тирозиновые протеинфосфатазы, ТПК — тирозиновые протеинкиназы, МАРК — митоген-активиру-емые киназы, УТФ — удельное тирозиновое фосфорилирование белков, ХАПС — 3-[(3-холамидопропил) диметил-аммоний]-1-пропансульфонат, ДТТ — дитиотрейтол, ТЕМЕД — тетраметилэтилендиамин, ПМСФ — фенилме-тилсульфонилфторид, ПВДФ мембраны — поливинил-дифторные мембраны, ИЭФ-буфер — буфер для изоэлект-рофокусирования, ТБСТ — Тпв-буфер солевой с Твином-20. * Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
сигнала участвуют Са2+-зависимые протеинкиназы, МАРК [14, 15], В1Ш киназа [16], а также липоксигеназный каскад [17].
Общеизвестна ключевая роль фосфорилиро-вания/дефосфорилирования белков в преобразовании и передаче информации в генетический аппарат клеток [18]. Фосфорилируются, главным образом, остатки серина, треонина, гисти-дина, аспартата и тирозина. В последнее время особое внимание привлекает тирозиновое фос-форилирование, несмотря на то, что его вклад в общее фосфорилирование белков невелик. В клетках позвоночных животных оно играет определяющую роль в регуляции роста, пролиферации, прохождении фаз клеточного цикла, интеграции цитоскелета в ответ на различные воздействия [19]. Гораздо меньше информации о роли тирозинового фосфорилирования белков у растений [20]. Имеются данные о протеинтиро-зинкиназной активности и фосфорилирован-ных по тирозину белках [21], в том числе белках цитоскелета профилина [22] и актина [23], об участии тирозинового фосфорилирования белков в ответе на действие элиситора [24], о его роли в соматическом эмбриогенезе [25, 26] и в транспорте ионов [27]. Нам не известны данные о влиянии БС на тирозиновое фосфорилирование белков. В связи с этим мы поставили задачу изучения тирозинового фосфорилирования белков растений и влияния на него брассиноли-да (БЛ).
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Растительный материал. Растения гороха (Pisum sativum L.) выращивали в условиях 10-ч фотопериода на питательной среде Хоглан-да—Арнона I в течение 9 дней. После отделения от корней побеги помещали в среду роста (контроль) или в среду с добавлением эффекторов (0,1 мкМ брассинолид, 100 мкМ ортованадат и 50 мкМ ФАО).
Приготовление образцов для анализа. Листья фиксировали в жидком азоте и гомогенизировали в среде (1 : 2), содержащей 50 мМ Tris-HCl, рН 7,5; 1 мМ ДТТ; 1 мМ ПМСФ; 10 мМ ЭДТА; 0,1 мМ ортованадат; 1 мМ теофиллин и 3% (m/V) поливинилпирролидон. Гомогенат центрифугировали в течение 10 мин при 5° и 16 000 g. Супернатант использовали сразу как для приготовления образца для одномерного (1D) электрофореза, так и для осаждения белка для двумерного (2D)-электрофореза. Приготовление образца для Ш-электрофореза проводили согласно методике Леммли [28]. Белки для 2D-электрофореза осаждали холодным 80% (m/V) ацетоном. Осажденный белок промывали 3 раза холодным ацетоном и 100 мкг белка растворяли в 150 мкл ИЭФ-буфера (8 М мочевина; 2 М тио-мочевина; 2% (m/V) ХАПС; 0,2% (V/V) амфоли-та pH 3-10; 3 мМ ДТТ и 20 мМ Tris).
Тирозиновое фосфорилирование растворимых белков листьев. Фосфорилирование белков по тирозину определяли с помощью методов одномерного или двумерного электрофореза с последующим проведением иммуноблоттинга с использованием моноклональных антител к фос-фотирозину PY 20.
Одномерный и двумерный электрофорез. 1D-электрофорез проводили согласно методике Леммли [28] в 6-20% градиенте ПААГ. Количество белка, нанесенного на трек, составляло 25 мкг. Для 2D-электрофореза полоски геля (стрипы) для изофоэлектрофокусировки с иммобилизованным градиентом pH (рН 3-10, 7 см длиной) регидратировали с образцами при 20° 12 ч в камерах для изофокусирования в следующем режиме: 15 мин при напряжении 250 В, затем напряжение линейно повышали до 4000 В в течение 2 ч, далее проводили изофокусировку образца при том же напряжении в течение 2 ч. Общее количество вольт-часов составило 24 000 при температуре 20° и силе тока 50 мкА на стрип. Затем стрипы 15 мин выдерживали в уравновешивающем буфере 1 (6 М мочевина, 2% (m/V) Ds-Na, 30% (V/V) глицерин, 50 мМ Tris-HCl, следы бромфенолового синего и 2% (m/V) ДТТ) и уравновешивающем буфере 2 (6 М мочевина, 2% Ds-Na, 30% глицерин, 50 мМ Tris-HCl,
0,005% бромфеноловый синий и 2,5% (m/V) йод-ацетамид). Оба конца стрипа (по 0,5 см) отрезали, а оставшуюся часть накладывали на 2D мини-гель (Tris-глицин, толщина 1 мм, 6—20% ПААГ). 2D-электрофорез проводили с использованием электродного буфера, содержащего 25 мМ Tris-HCl, 192 мМ глицина и 0,1% Ds-Na, при силе тока 5 мА на 1 гель в течение 20 мин, затем при 10 мА в течение 120—150 мин.
Иммуноблоттинг. Для изучения белков, фос-форилированных по тирозину, после 1D- или 2D-электрофореза белки переносили на ПВДФ мембраны в течение 90 мин при постоянной величине электрического тока 150 мА согласно стандартному протоколу, используя прибор для полусухого блотинга. Затем мембраны в течение 1 ч блокировали 1% (m/V) БСА, растворенным в ТБСТ (10 мМ Tris-HCl, рН 7,5; 10 мМ NaCl и 0,05% Твин-20) при 5°. Блоты затем инкубировали 1 ч при комнатной температуре с антителами к фосфотирозиновым белкам PY20, конъюгирован-ными с пероксидазой хрена в разведении 1 : 1000 в ТБСТ. Для визуализации тирозинового фосфо-рилирования белков блоты инкубировали 1 мин в хемилюминесцентном реагенте (ECL-реагенте) и экспонировали на рентгеновской пленке, белки мембран окрашивали 0,1% Кумасси R-250 10 мин, затем отмывали 50 % этанолом.
Анализ полученных данных. Так как действие брассинолида и ванадата на побеги было относительно непродолжительным, то за это время изменения содержания белков практически не происходило и, в связи с этим, интенсивность хемилюминесценции давала необходимую информацию об уровнях тирозинового фосфори-лирования белков. Однако при сопоставлении фосфорилирования различных индивидуальных белков необходимо было учитывать, что интенсивность хемилюминесценции (ECL) зависит от содержания белков. В связи с этим определяли величину отношения интенсивности хемилю-минесценции к содержанию того или иного белка. Для вычисления удельного тирозинового фосфорилирования белков, разделенных элект-рофоретически, мембраны, окрашенные Кумасси R-250, и радиоавтографические пленки с фосфорилированными белками сканировали с помощью Epson Perfection 3170 Photo. Сканированное изображение данных Ш-электрофореза переводили в числовые значения оптической плотности с помощью программы Image Master 1D- (Англия), а 2D-электрофореза — с помощью программы Flicker (http://open2dprot.source-forge.net/Flicker) (США). Удельное тирозиновое фосфорилирование выражали как отношение оптической плотности фосфорилированного белка (хемилюминесценции), идентифициро-
ванного на радиоавтографической пленке, к оптической плотности того же самого белка, идентифицированного на мембране, окрашенной Кумасси R-250. Величину удельного тирозино-вого фосфорилирования оценивали в относительных единицах (отн. ед.) и обозначали как УТФ.
Количественное определение белка. Количество белка измеряли согласно методу Брэдфорд [29], используя БСА в качестве стандарта.
Реактивы. В работе использованы Tris-HCl, глицин, ДТТ, ортованадат натрия, мочевина, тио-мочевина, ХАПС, йодацетамид, амфолиты, стрипы для изофокусировки, поливинилпирро-лидон, Ds-Na, ТЕМЕД, глицин, бромфеноло-вый синий, персульфат аммония, акриламид, Кумасси R-250 и G-250, а также метилен-бис-акриламид фирмы «Bio-Rad» (США). Монокло-нальные антитела к белкам, фосфорилирован-ным по тирозину (клон PY20), ПВДФ мембраны, хемилюминесцентный реагент (ECL-реагент), Твин 20 и БСА были получены в «Amersham Pharmacia Biotech» (Англия). ПМСФ, ЭДТА и теофиллин были поставлены фирмой «Sigma» (США). Использовали рентгеновскую пленку, NaCl, глицерин отечественного производства. Брассинолид был синтезирован в Институте биоорганической химии БНАН (Беларусь).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Среди полипептидов проростков гороха преобладают ПП, характеризующиеся молекулярной массой 15 и 47 кДа. С большой долей вероятности эти
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.