МЕХАНИЗМЫ ПРОЛИФЕРАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ КЛЕТОК
УДК 577.152.1
ВЛИЯНИЕ D,L-БУТИОНИН-S,R-СУЛЬФОКСИМИНА НА СООТНОШЕНИЕ ФОРМ ГЛУТАТИОНА И РОСТ КАЛЛУСОВ
ГРЕЧИХИ ТАТАРСКОЙ © 2014 г. Л. Р. Нигматуллина, Н. И. Румянцева*, Ю. А. Костюкова
Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН 420111 Казань, ул. Лобачевского, д. 2/31 E-mail: nat_rumyantseva@mail.ru Поступила в редакцию 07.05.13 г. Окончательный вариант получен 09.09.13 г.
Исследовали внутриклеточное содержание восстановленной (GSH) и окисленной (GSSG) форм глутатиона, активности глутатионредуктазы, глутатион^-трансферазы и аскорбатпероксидазы в морфогенном и неморфогенном каллусах гречихи татарской в ходе культурального цикла, а также при воздействии Б,Ь-бутионин-8,Я-сульфоксимина (БСО) — ингибитора первого фермента биосинтеза глутатиона — у-глутамилцистеинсинтазы. Было установлено, что в ходе пассажа культуры незначительно отличались по содержанию общего глутатиона, но содержание GSH было выше в мор-фогенной культуре, а содержание GSSG — в неморфогенной культуре. В морфогенном каллусе активность глутатион^-трансфераз была в 10—20 раз выше, а активность глутатионредуктазы в 2—2.5 раза ниже, чем в неморфогенном. При действии БСО снижение содержания GSH в морфогенном каллусе было временным (на 6—8 сутки пассажа), а в неморфогенном оно снижалось уже через сутки и оставалось ниже, чем в контроле на протяжении всего пассажа. БСО не влиял на содержание GSSG в морфогенном каллусе, а в неморфогенном вызывал его накопление. Эти различия, вероятно, обусловлены тем, что на среде с БСО в морфогенном каллусе происходит активация глутатионредуктазы, а в неморфогенном каллусе, наоборот, глутатионредуктаза ингибируется. Несмотря на то, что БСО вызывал снижение общего содержания глутатиона только в неморфогенной культуре, цито-статический эффект БСО был более выражен в морфогенном каллусе. БСО также оказывал негативное влияние на дифференцировку проэмбриональных клеточных комплексов в морфогенном каллусе. Обсуждается роль редокс-статуса глутатиона в поддержании эмбриогенной активности культивируемых клеток растений.
Ключевые слова: Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn., морфогенный каллус, неморфогенный каллус, GSH, GSSG, глутатионредуктаза, глутатион^-трансфераза, В^-бутионин^,К-сульфоксимин, соматический эмбриогенез.
DOI: 10.7868/S0475145014010054
ВВЕДЕНИЕ Трипептид глутатион (у-глутамил-цистеинил-глицин) является основным редокс-буфером в клетках животных, присутствуя в двух формах — восстановленной (08И) и окисленной (0880). В растениях преимущественный вклад в создание внутриклеточного редокс-буфера вносят аскор-бат и дегидроаскорбат. Тем не менее, функции глутатиона в клетках растений столь же важны и многообразны, как и в клетках животных: глута-
Принятые сокращения: БСО — В,Ь-бутионин-8,К-суль-фоксимин, ПЭКК — проэмбриональный клеточный комплекс, АФК — активные формы кислорода, ФМСФ — фе-нилметилсульфонилфторид.
тион напрямую участвует в защите клеток от окислительного стресса, являясь скэвенджером супероксид-аниона, гидроксил-радикала и син-глетного кислорода, выполняет функцию субстрата для работы таких антиоксидантных ферментов как глутатион^-трансферазы, глутатионпероксидазы, дегидроаскорбатредуктазы. Глутатионилирование — одна из важнейших посттрансляционных модификаций белка, которая защищает тиол-содержащие белки от окислительного повреждения и, вследствие обратимости реакции, способствует модуляции их внутриклеточной активности (Dixon et al., 2005). Глутатион участвует в регуляции клеточного цикла растений, хотя механизм этой ре-
гуляции, полностью не выяснен (Sanchez-Fernandez et al., 1997; Vernoux et al., 2000). В растениях глутатион — это основной источник запасной серы, которая особенно важна в ходе эмбрионального развития растений (Foyer et al., 2001). Показано, что глутатион участвует в регуляции различных морфогенетических процессов как in vivo, так и in vitro (Kerk et al., 2000; Jiang et al., 2003; Tybursky et al., 2010).
Образование дисульфидной связи при окислении двух молекул восстановленного глутатио-на приводит к образованию GSSG — окисленной формы глутатиона. Накопление GSSG в клетках животных, индуцируемое окислительным стрессом, является токсичным и может индуцировать апоптоз (Filomeni et al., 2005). Причем, индукция апоптоза определяется не избытком АФК, а уровнем деплеции (истощения) GSH (Franco et al., 2007). В клетках животных величина соотношения GSH/GSSG отражает развитие стресса и используется как дополнительный индикатор для диагностирования различных патологий. Показано, что в растениях при разных видах стресса также происходит снижение в клетках GSH и увеличение GSSG (Ruiz et al., 2002). Устойчивые генотипы растений характеризуются большим содержанием GSH, при действии различных стрессоров в них наблюдается активация ферментов аскорбат/ глутатионового цикла.
Культуры клеток растений имеют разную способность к регенерации растений in vitro, поэтому в зависимости от проявления этой способности их подразделяют на морфогенные и неморфогенные культуры. Среди морфогенных культур в исследованиях, как фундаментального плана, так и в биотехнологических разработках, чаще всего используются так называемые эмбриогенные линии, характеризующиеся высокой частотой регенерационной активности. Основной путь морфогенеза в таких линиях — соматический эмбриогенез. Как правило, эм-бриогенные линии имеют "нодулярный" фенотип, который характеризуется наличием проэм-бриональных клеточных комплексов (ПЭКК), или, согласно другой терминологии, проэм-бриогенных масс (Finer et al., 1994). ПЭКК, в зависимости от видовой и даже сортовой принадлежности культуры, могут быть проэмбрио или даже глобулярными зародышами, остановленными в развитии добавлением ауксина в среду культивирования. Значительную массу каллу-сной ткани эмбриогенных культур составляет рыхлая ткань-нянька (или "мягкий" каллус), которая образуется при разрыхлении предсуще-
ствующих ПЭКК. Эта ткань является метаболически активной, но ее клетки не способны к активному делению, в отличие от клеток ПЭКК, и, в конечном счете, стареют и погибают. Нами показано, что в морфогенном каллусе гречихи татарской (Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn.), который является типичной нодулярной культурой, постоянно поддерживается цикл воспроизведения ПЭКК, запускаемый пересадкой каллуса на новую среду с 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой (Румянцева и др., 2003; Румянцева и др., 2004). Морфогенные каллусы гречихи татарской сохраняют способность к морфогенезу в течение нескольких лет культивирования, не-морфогенные клоны возникают в них редко и сразу характеризуются рыхлым фенотипом и отсутствием ПЭКК, полиплоидией, быстрым ростом, не способностью ни к какому типу диффе-ренцировки. Ранее нами было показано, что для неморфогенных культур по сравнению с мор-фогенными характерно высокое содержание перекиси водорода и повышенный уровень пе-рекисного окисления липидов, низкая активность каталазы и высокая активность суперок-сиддисмутазы (Камалова и др., 2009), в них содержится меньше фенолов, и они отличаются по качественному составу (Сибгатуллина и др., 2012). Мы предположили, что культуры, способные к регенерации, должны иметь высокий уровень антиоксидантной защиты, который, с одной стороны, позволяет защищать генетический аппарат клеток от повреждений, вызываемых АФК, а, с другой стороны, эффективно контролировать редокс-регуляцию сигналлинга.
В настоящей работе мы исследовали влияние ЭХ-бутионин^Д-сульфоксимина (БСО) — ингибитора первого фермента биосинтеза глутатиона — у-глутамилцистеинсинтазы на ре-докс-статус глутатиона и рост каллусов гречихи татарской.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
В качестве объекта исследования использовали морфогенные и неморфогенные каллусы гречихи татарской Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn. Морфогенные каллусы были получены из незрелых зародышей как описано ранее (Румянцева и др., 1989; Румянцева и др., 1992; Румянцева и др., 1998; Лукина и др., 1999). Линия морфоген-ного каллуса Fagopyrum tataricum (L.) 1—8 была получена в 2005 году и поддерживалась in vitro в течение 8-ми лет. Морфогенная культура имела типичный нодулярный морфотип и состояла из ПЭКК и "мягкого" каллуса. Морфогенные кал-
лусы сохраняли морфологию, диплоидное число хромосом и способность к соматическому эмбриогенезу и геммогенезу в течение длительного времени культивирования (несколько лет) (Румянцева и др., 1989; Румянцева и др., 1998). Неморфогенный каллус линии 1-8р, состоящий только из клеток паренхимного типа, был отсе-лектирован как клон, сформированный на мор-фогенном каллусе. Неморфогенный каллус отличался от морфогенного каллуса рыхлой структурой, высокой скоростью роста, значительной генетической вариабельностью (хромосомные числа от n до 8n) и полной утратой способности к морфогенезу. Каллусные культуры поддерживали в термостате при температуре 25 ± 0.5°С, в темноте на каллусогенной среде RX (Румянцева и др., 1998). Морфогенные каллусы характеризовались способностью формировать соматические зародыши на безгормональной среде MS, а также почки на среде RX с добавлением 6-бензиламинопурина и индоли-луксусной кислоты. Неморфогенный каллус пересаживали через каждые 2 недели, морфо-генный каллус — через каждые 3 недели. О характере роста каллусной культуры судили по приросту сырой массы ткани за определенные промежутки времени.
Определение общего содержания, восстановленной и окисленной форм глутатиона проводили согласно методу, описанному Занг и др. (Zhang etal., 1996). Содержание общего глутатиона оценивали в ходе цветной реакции при образовании комплекса 5,5'-дитиобис-2-нитробензойной кислоты и GSH. Содержание GSSG оценивали при помощи 2-винилпиридина, который связывается с GSH и маскирует его. Навеску каллусной ткани (250 мг) растирали в 1 мл 5%-ной 5-сульфосали-циловой кислоты. Гомогенат центрифугировали (5 мин, 10000 g) и полученный супернатант делили на две части. К одной части супернатанта добавляли 375 мкл 0.5 М Na-фосфатного буфера (рН 7.5) и 12 мкл дистиллированной воды (эту пробу использовал
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.