РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2014, том 54, № 2, с. 169-173
МОДИФИКАЦИЯ РАДИАЦИОННЫХ ЭФФЕКТОВ
УДК [57+61]::539.1.04:611.4
ВЛИЯНИЕ ДИМЕТИЛСУЛЬФОКСИДА НА ВЫХОД ОДНОНИТЕВЫХ РАЗРЫВОВ И ЩЕЛОЧНОЛАБИЛЬНЫХ САЙТОВ ДНК В НУКЛЕОИДАХ ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ 365 НМ УФ-ИЗЛУЧЕНИЯ
© 2014 г. Н. М. Сметанина1, 2, М. В. Пустовалова2, А. Н. Осипов2,3, *
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва 2Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна ФМБА России, Москва 3Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Москва
Показано, что воздействие 365 нм УФ-излучения в дозах 10, 20 и 50 кДж/м2 индуцирует дозозависи-мое увеличение однонитевых разрывов и щелочнолабильных сайтов (ОР и ЩС) ДНК, регистрируемых методами ДНК-комет и ДНК-гало, в нуклеоидах лимфоцитов периферической крови человека. Добавление 10% диметилсульфокида (ДМСО) снижает выход ОР и ЩС ~ в 3 раза. Резкое снижение выхода УФ-А-индуцированных ОР и ЩС ДНК в нуклеоидах лимфоцитов в присутствии ДМСО свидетельствует о ведущей роли * ОН радикала в образовании этих повреждений ДНК при воздействии 365 нм УФ-излучения.
Повреждения ДНК, метод ДНК-гало, метод ДНК-комет, ультрафиолетовое излучение, диметилсуль-фоксид, лимфоциты.
DOI: 10.7868/S0869803114020118
Спектральный диапазон естественного солнечного ультрафиолетового излучения (УФ) на поверхности Земли составляет 280—400 нм, при этом длинноволновое/ближнее (315—400 нм) УФ-излучение (согласно международной классификации — УФ-А) является основным его компонентом (90—95%). УФ-А излучение, в свою очередь, подразделяется на УФ-А2 (315—340 нм) и УФ-А1 (340-400 нм). При этом 75% УФ-А излучения приходится именно на долю УФ-А1. Искусственное УФ-А1 излучение в настоящее время повсеместно используется в косметических целях для загара кожи.
Долгое время считалось, что УФ-А излучение относительно безвредно, но результаты последних исследований заставляют пересмотреть представления как о механизмах его биологического действия, так и о последствиях его воздействия для человека [1]. Выход циклобутановых пирими-диновых димеров при воздействии УФ-А излучения на эукариотические клетки оказался намного выше, чем предполагалось ранее, исходя из результатов, полученных на растворах ДНК [2-3]. Показано, что длительное воздействие УФ-А излучения вызывает лизосомальную дисфункцию в
* Адресат для корреспонденции: 123182 Москва, ул. Живописная, 46, ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России; тел.: (499) 190-96-83; е-шаП: andreyan.osipov@gmail.com.
фибробластах кожи человека [4], онкотрансфор-мацию в культивируемых кератиноцитах человека [5] и развитие сарком кожи у "голых" мышей
[6]. Неясна роль УФ-А излучения в развитии ме-ланом. Большая часть экспериментальных работ свидетельствуют о том, что УФ-А излучение не индицирует меланомы у модельных животных
[7], тогда как эпидемиологические данные говорят о наличии положительной корреляции между количеством посещений солярия и частотой ме-ланом у человека [8].
Большинство работ по изучению биологического действия УФ-А излучения сосредоточенно на эффектах в клетках базального слоя кожи. Однако, в отличие от более коротковолнового 280— 315 нм (УФ-В) излучения, которое почти полностью поглощается эпидермисом, УФ-А излучение проникает в глубокие слои кожи и оказывает воздействие на дерму, которая богата капиллярами. При этом происходит облучение клеток периферической крови, в том числе и лимфоцитов. Показано, что УФ-А излучение вызывает увеличение однонитевых разрывов и щелочнолабильных сайтов (ОР и ЩС) ДНК в лимфоцитах крови как при воздействии на клетки in vitro [9], так и при облучении всего организма [10]. Механизм образования ОР и ЩС ДНК в лимфоцитах перифери-
170
СМЕТАНИНА и др.
ческой крови при воздействии УФ-А излучения до сих пор является предметом дискуссий.
Цель нашей работы состояла в изучении влияния скавенджера 'ОН радикала — диметилсуль-фоксида (ДМСО) на выход ОР и ЩС ДНК, индуцированных 365 нм УФ-излучением в нуклеоидах лимфоцитов периферической крови человека.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Для исследований использовали кровь физически здоровых мужчин-доноров в возрасте 21— 28 лет. Забор периферической крови проводили в K2EDТА-вакугейнеры ("Vacuette"). У всех доноров было получено согласие на проведение данного исследования.
Выделение лимфоцитов крови человека проводили путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографин ("Histopaque", "Sigma-Aldrich") в соответствии с прилагаемой инструкцией. После выделения лимфоциты отмывали и ресуспензировали в фосфатно-солевом буфере до конечной концентрации 1 х 106 клеток/мл.
Для изучения влияния ДМСО на выход УФ-А-индуцированных повреждений ДНК в нуклеои-дах лимфоцитов 200 мкл суспензии клеток смешивали с 600 мкл 1%-ного раствора легкоплавкой агарозы (тип IV) в фосфатно-солевом буфере (рН 7.4) при температуре 37.5°С. 60 мкл полученной суспензии клеток в жидкой агарозе наносили на предварительно покрытые слоем 1%-ной нор-моплавкой агарозы предметные стекла, накрывали покровными стеклами и оставляли на 10 мин при 4°C до образования плотного геля. Полученные агарозные слайды с иммобилизированными в них клетками (далее агарозные слайды) инкубировали 1 ч при 4°С в лизирующем буфере (2.5 моль/л NaCl, 100 ммоль/л Na2EDTA, 20 ммоль/л Трис-HCl, pH 10.0, 1% Triton X-100) без ДМСО или с добавлением 10% ДМСО ("Appli-Chem").
Нуклеоиды клеток облучали при 4°С на установке BLX-365 ("Bio-Link"). Длина волны — 365 ± 10 нм. Дозы: 10, 20 и 50 кДж/м2. Интенсивность — 2.92 кДж/м2 за 1 мин.
Анализ ОР и ЩС проводили двумя методами:
1) метод ДНК-комет в щелочных условиях [11, 12]. Сразу после облучения агарозные слайды переносили в холодный (4°С) щелочной раствор (300 ммоль/л NaOH, 1 ммоль/л Na2EDTA, рН > 13) и выдерживали 20 мин для расплетания (щелочной денатурации) нитей ДНК. Электрофорез проводили в щелочном буфере при напряжении 0.75 В/см при комнатной температуре в те-
чение 20 мин. После электрофореза проводили нейтрализацию для ренатурации (восстановления нативности) ДНК (3-кратная промывка в 0.4 моль/л Трис-НС1 буфере, рН 7.4). Затем слайды слегка подсушивали и фиксировали в 70%-ном этаноле в течение 10 мин. Для окраски ДНК использовали SybrGreen I ("Invitrogen"). Визуализацию ДНК-комет проводили с помощью люминесцентного микроскопа Axioscop-40 FL ("Carl Zeiss", Германия) и видеосистемы на основе цифровой камеры MRс 5 ("Carl Zeiss") с программой AxioVision 4.8 ("Carl Zeiss"). На каждом слайде регистрировали по 100 комет. Обрабатывали по три слайда от каждого донора на экспериментальную точку. Для анализа и обработки микрофотоизображений ДНК-комет использовали программу СASP 1.2.2 ^ASPlab). В качестве критерия поврежденности ДНК использовали % ДНК в хвосте ДНК-комет;
2) модифицированный метод ДНК-гало в щелочных условиях [13]. Слайды переносили в холодный (4°C) щелочной раствор (300 ммоль/л NaOH, 2 ммоль/л Na2EDTA, рН > 13) и выдерживали 20 мин, после чего проводили 3-кратную промывку в трис-боратном буфере, рН 8.2. Слайды фиксировали в 70%-ном этаноле в течение 10 мин. Для окраски ДНК использовали SybrGreen I ("Invitrogen"). Визуализацию ДНК-гало проводили с помощью люминесцентного микроскопа Люмам Р-8 ("ЛОМО", Россия) с использованием системы визуализации микрофотоизображений "Микромед-1600-3ф" ("ЛОМО"). На каждом слайде регистрировали по 100 нуклео-идов. На каждую точку обрабатывали по три слайда от каждого донора. В зависимости от степени диффузии ДНК нуклеоиды относили к одному из трех классов: А — отсутствие гало; Б — гало присутствует, но при этом размеры и интенсивность флуоресценции ядерной области меняются незначительно; B — максимальная выраженность гало, большая часть ДНК фрагменти-рована. Индекс ДНК-гало рассчитывали по формуле
ИДГ = (0 х nA + 1 х пБ + 2 х пВ)/Е,
где nA, пБ и nB — число нуклеоидов в категориях A, Б и B, а Е — сумма всех подсчитанных нуклеоидов.
Статическая обработка результатов проводилась с использованием пакета статистических программ Statistica 8.0 (StatSoft). Результаты исследований представлены как среднее арифметическое результатов трех независимых экспериментов ± стандартная ошибка.
ВЛИЯНИЕ ДИМЕТИЛСУЛЬФОКСИДА НА ВЫХОД ОДНОНИТЕВЫХ РАЗРЫВОВ
171
Рис. 1. Зависимость изменений относительного количества ОР и ЩС ДНК, индуцированных 365 нм УФ-излучением, в нуклеоидах лимфоцитов периферической крови человека при облучении в буфере без ДМСО (1) и с 10 % ДМСО (2), полученная с помощью метода ДНК-комет.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В наших предыдущих работах было продемонстрировано, что при воздействии излучения на лимфоциты периферической крови человека in vitro наблюдается зависящее от дозы увеличение количества ОР и ЩС ДНК [12, 13]. И хотя облучение лимфоцитов проводилось при низкой температуре (4°С), когда метаболические процессы клеток сильно замедленны, мы не могли полностью исключить вклад эксцизионной репарации ДНК и свободных радикалов, продуцируемых в митохондриях, в наблюдаемые эффекты. Поэтому в настоящей работе исследования проводились на нуклеоидах лимфоцитов в буфере, содержащем ингибитор нуклеаз (Na2EDTA), т.е. на модели и в условиях, где вышеперечисленные процессы были полностью исключены.
Результаты исследований показали, что 365 нм УФ-излучение в дозах 10, 20 и 50 кДж/м2 индуцирует дозозависимое увеличение ОР и ЩС ДНК в нуклеоидах, регистрируемых методом ДНК-комет (рис. 1, кривая 1). Зависимость доза—эффект можно описать линейным уравнением
у = 3.51 + 1.14х (R2 = 0.967),
где у — % ДНК в хвосте ДНК-комет, а х — доза облучения в кДж/м2. Однако гораздо лучше эта зависимость аппроксимируется линейно-квадратичной функцией
Индекс ДНК-гало, усл. ед.
Доза, кДж/м2
Рис. 2. Зависимость изменений относительного количества ОР и ЩС ДНК, индуцированных 365 нм УФ-излучением, в нуклеоидах лимфоцитов периферической крови человека при облучении в буфере без ДМСО (1) и с 10 % ДМСО (2), полученная с помощью метода ДНК-гало.
у = 3.51 + 0.57х + 0.013х2 (Я2 = 0.999).
Добавление в буфер для облучения 10% ДМСО заметно снижало выход ОР и ЩС ДНК в нуклеоидах (рис. 1, кривая
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.