ФИЗИОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА, 2015, том 41, № 3, с. 82-89
УДК 612.74,577.29
ВЛИЯНИЕ ДЛИТЕЛЬНОСТИ ОДНОКРАТНОЙ АЭРОБНОЙ НАГРУЗКИ НА РЕГУЛЯЦИЮ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО БИОГЕНЕЗА В СКЕЛЕТНОЙ МЫШЦЕ ТРЕНИРОВАННЫХ ЛЮДЕЙ
© 2015 г. Д. В. Попов1,2, Е. А. Лысенко1, Т. Ф. Миллер1, А. В. Бачинин1, Д. В. Перфилов1, О. Л. Виноградова1,2
1ФГБУНГНЦ РФ — Институт медико-биологических проблем РАН, Москва 2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова E-mail: danil-popov@yandex.ru Поступила в редакцию 10.12.2014 г.
Изучали влияние длительности однократной аэробной нагрузки умеренной интенсивности (60% от Vo) на активацию сигнальных киназ, регулирующих экспрессию гена PGC-1a, а также экспрессию генов-регуляторов митохондриального биогенеза и генов, участвующих в регуляции катаболизма. 9 спортсменов ( Vo 59 мл/мин/кг) выполнили на велоэргометре три нагрузки длительностью 30, 60 и 90 мин. Было ¡показано, что вызванное нагрузкой увеличение экспрессии гена PGC-1a происходит без активации киназ AMPK, p38 MAPK и CAMKII. Нагрузки продолжительностью 60 и 90 мин вызывают сопоставимое увеличение экспрессии гена PGC-1a, тогда как увеличение экспрессии VEGFA было найдено только после 90-минутной нагрузки. Следует отметить, что даже 90-минутные нагрузки такой интенсивности не вызывают активации сигнального пути FOXO1—E3 убиквитин лигаз и увеличение экспрессии генов, участвующих в регуляции катаболизма.
Ключевые слова: физическая нагрузка, скелетная мышца, экспрессия гена, PGC-1a.
Б01: 10.7868/80131164615030121
Адаптация скелетных мышц и организма в целом к физическим нагрузкам зависит от характеристик предъявляемых нагрузок. Важнейшими характеристиками упражнения являются интенсивность и длительность. В последнее десятилетие молекулярные механизмы адаптации скелетной мышцы человека в ответ на однократную аэробную нагрузку были хорошо изучены. Было показано, что ключевая роль в регуляции мито-хондриального биогенеза принадлежит белку РОС-1а (коактиватору 1а рецептора гамма, активируемого пролифераторами пероксисом). Мышечная активность приводит к активации различных сигнальных киназ, таких как аденозин-монофосфат (АМФ)-зависимая протеинкиназа (АМРК), кальций/кальмодулин-зависимая протеинкиназа (СаМК) и митоген-активируемая протеинкиназа р38 МАРК [1], а также никотина-миддинуклеотид (НАД)-зависимая деацетилаза (8ц1-1) [2]. Это приводит к увеличению экспрессии гена РОС-1а (РРАЯОС1А), а также к активации уже имеющегося в клетке белка РОС-1а. После аэробных упражнений активированный РОС-1а транслоцируется в ядро [3], где коакти-вирует целый ряд ядерных рецепторов и транскрипционных факторов, ответственных за экс-
прессию генов-регуляторов митохондриального биогенеза [4] и ангиогенеза [5].
Влияние интенсивности однократных аэробных нагрузок на регуляцию митохондриального биогенеза было изучено в ряде работ. Активация киназ АМРК [1, 6-9] и САМК11 [1, 10], реагирующих на изменение внутримышечного содержания АМФ и ионов кальция, соответственно, положительно связана с интенсивностью упражнения, тогда как для стресс-индуцируемой киназы р38 МАРК такой зависимости не было найдено [1]. Через 3-5 ч после окончания нагрузки происходит увеличение экспрессии гена РОС-1а, которое линейно зависит от интенсивности аэробной нагрузки в диапазоне от умеренной до максимальной [1, 11-13].
Влияние продолжительности аэробных упражнений на активацию АМРК, САМК11 и р38 МАРК изучалось в нескольких работах. Уровень фосфорилирования этих киназ, а также уровень фосфорилирования их субстратов, который можно использовать как маркер активации вышележащих киназ, возрастали в первые 10-30 мин нагрузки с интенсивностью ~70% от Ко2тах (максимальной скорости потребления кислорода
организмом) и затем не изменялись вплоть до 60— 90-й минуты [7, 10, 14, 15]. Можно предположить, что чем больше будет продолжительность упражнения и, соответственно, время нахождения этих киназ в активном состоянии, тем больше будет последующее увеличение экспрессии гена PGC-1a, а также активация белка PGC-1a, что косвенно должно подтверждаться увеличением экспрессии его генов-мишеней. В доступной нам литературе не было найдено работ, изучавших влияние длительности однократной аэробной нагрузки на изменение этих показателей. Задачей нашего исследования было изучить влияние длительности однократной аэробной нагрузки умеренной интенсивности на экспрессию генов-регуляторов митохондриального биогенеза и на активацию сигнальных киназ, регулирующих экспрессию гена PGC-1a.
Белковый обмен в скелетной мышце зависит от скорости синтеза и деградации белка [16]. Известно, что аэробные упражнения не стимулируют увеличение скорости синтеза мышечных белков [17] и могут активировать их катаболизм. Последнее связано с активацией убикви-тин протеасомной системы, которая, по крайней мере частично, зависит от активации AMPK [18, 19]. Влияние аэробных упражнений на регуляцию этой системы исследовано недостаточно, поэтому второй задачей настоящей работы было изучить влияние аэробных нагрузок различной длительности на сигнальный путь FOXO1 (forkhead box O1) — E3 убиквитин лигаз (MuRF1 и MAFbx) и экспрессию гена миостатина и фолистатина.
Известно, что в мышцах нетренированного человека увеличение экспрессии различных генов после первой тренировочной сессии может быть выше, чем после последующих [20, 21]. В нашем исследовании, чтобы избежать такого увеличенного ответа на первую тестовую нагрузку, участвовали люди, адаптированные к регулярным аэробным нагрузкам. Продолжительность исследуемых нагрузок была 30, 60 и 90 мин; интенсивность нагрузок была умеренная (~60% Fo2max), поскольку такая интенсивность широко используется в практике длительных аэробных упражнений.
МЕТОДИКА
В исследовании приняли участие 9 спортсменов-любителей, тренирующих аэробные возможности (бегуны, велосипедисты и лыжники, вес 72 (67—77) кг — медиана и межквартильный размах,
рост 1.78 (1.72-1.82) м, ¥о2юж 59 (51-62) мл/мин/кг веса тела). Исследование было одобрено комиссией по биоэтике Института медико-биологических проблем РАН и соответствовало нормативам
Хельсинкской декларации. Все добровольцы дали письменное согласие на участие в исследовании.
В течение первого визита в лабораторию испытуемые знакомились с тестовыми процедурами. Два дня спустя каждый испытуемый выполнил тест с возрастающей нагрузкой до отказа на вело-эргометре Ergoselect 200 (Ergoline, Германия). Начальная нагрузка, прирост нагрузки и скорость вращения педалей 0 В, 15 В/мин и 60 об./мин, соответственно. Тест продолжался до отказа от выполнения работы. Критериями отказа были снижение частоты вращения педалей до 50 об./мин и увеличение дыхательного коэффициента более чем 1.1. Скорость потребления кислорода организмом ( Vo2) измерялась каждые 20 с в камере смешения с помощью газового медицинского масс-спектрометра AMIS 2000 (Innovision, Дания). Наибольшее значение Vo было взято как FO
Все испытуемые были проинструктированы избегать тяжелых аэробных нагрузок и силовых упражнений в течение 1 недели и избегать всех упражнений за 36 ч до теста. Испытуемые приходили в лабораторию в 08:30 и получали стандартизованный завтрак (3624 кДж; 24 г белка, 157 г углеводов и 15 г жиров). Физическая нагрузка начиналась через 1 ч 45 мин после завтрака и состояла из разминки (5 мин, 50% FO2max) и основной части (25 или 55 или 85 мин, 60% FO2max). Через 30 мин после окончания нагрузки испытуемые получали стандартизованный обед (3650 кДж; 29 г белка, 116 г углеводов и 43 г жиров). Субъективная оценка тяжести (СОТ) работы оценивалась по 10-балльной шкале Борга СШ0. Пробы крови из кончика пальца брались каждые 15 мин во время нагрузки для оценки содержания лактата в крови (Super GL Easy analyzer, Dr. Mueller Gera-etebau GmbH, Германия). Концентрация свободных жирных кислот (СЖК) в капиллярной крови оценивалась на 30-й, 60-й и 90-й минутах нагрузки с помощью NEFA FS kit (DiaSys Diagnostic Systems, Германия). Пробы ткани из m. vastus lateralis брались с помощью метода микробиопсии [22] до, через 10 мин, 3 ч и 5 ч после окончания нагрузки под локальной анастезией (2 мл 2% лидокаин). Пробы ткани помещались на фильтровальную бумагу для удаления крови и видимых кусков соединительной и жировой ткани, замораживались в жидком азоте через 20 с после взятия и затем хранились при —80°C до анализа. Первая биопсия была взята на 12 см проксималь-нее condylus lateralis ossis femori, последующие биопсии брались на 2 см проксимальнее предыдущей.
РНК выделялась из кусочка ткани (приблизительно 20 мг) с помощью RNeasy Mini kit (Qiagen, Германия). Концентрация РНК и ее чистота оценивалась спектрофотометрически (SmartSpec
Таблица 1. Праймеры полимеразной цепной реакции и размер получаемого продукта
мРНК Прямой праймер Обратный праймер Размер продукта
PPARGClA (PGC-la) CAGCCTCTTTGCCCAGATCTT TCACTGCACCACTTGAGTCCAC 127
PPRCl GCTGAAACAGAGGTTCTCCG AAAGTCTTCCCGGTTGGAGT 238
TFAM AGATTCCAAGAAGCTAAGGGTGATT TTTCAGAGTCAGACAGATTTTTCCA 85
TFB2M CAAGGAAGGCGTCTAAGGC AGCAGTAGGTGTGGAGGTC 118
CS GAGAAGGCAGCGGTATTG AGGTAAGGGTCGGAAAGG 196
COX2 CGACTACGGCGGACTAATCT TCGATTGTCAACGTCAAGGA 91
VEGFA TACCTCCACCATGCCAAG GGTACTCCTGGAAGATGTC 148
PDK4 CTACTCGGATGCTGATGAAC ATCTTGGACCACTGCTACC 116
HADH AGGCTGTATGAACGAGGTGAC GGGCTGGGCTGATGTAATGG 179
TRIM63 (MURF1) CTCAGTGTCCATGTCTGGAGGCCGTT GGCCGACTGGAGCACTCCTGTTTGTA 147
FBXO32 (MAFbx) GTCCAAAGAGTCGGCAAGTC AGGCAGGTCAGTGAAGGTG 147
MSTN CATGATCTTGCTGTAACCTTCC CGATAATCCAATCCCATCC 195
FST GGAAAACCTACCGCAATGAA GAGCTGCCTGGACAGAAAAC 124
GAPDH CAAGGTCATCCATGACAACTTTG GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG 496
ACTB CGTGACATTAAGGAGAAGCTGTGC CTCAGGAGGAGCAATGATCTTGAT 375
Примечание.PPARGC1A (PGC-la) - peroxisome proliferator-activated receptor gamma, coactivator 1 alpha; PPRC1 - peroxisome pro-liferator-activated receptor gamma, coactivator-related 1; TFAM - transcription factor A, mitochondrial; TFB2M - transcription factor B2, mitochondrial; CS - citrate synthase; COX2 - cytochrome c oxidase subunit II; VEGFA - vascular endothelial growth factor A; PDK4 -pyruvate dehydrogenase kinase, isozyme 4; HADH - hydroxya
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.