НЕЙРОХИМИЯ, 2011, том 28, № 1, с. 78-82
КРАТКИЕ ^^^^^^^^^^^^^^^^ СООБЩЕНИЯ
УДК 612.112.94
ВЛИЯНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА pub ЧЕЛОВЕКА НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ КЛЕТОК ФЕОХРОМОЦИТОМЫ КРЫСЫ
ЛИНИИ РС-12
© 2011 г. Е. В. Новосадова, Е. Л. Арсеньева, А. Г. Кобылянский, А. Н. Лебедев, Е. С. Мануилова, В. З. Тарантул, Н. В. Хайдарова, И. А. Гривенников*
Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН, Москва
На модели клеток феохромоцитомы крысы линии РС-12 изучено влияние повышенной экспрессии гена pub человека на пролиферацию и нейрональную дифференцировку этих клеток под действием фактора роста нервов. С этой целью были получены стабильно трансфицированные линии клеток с повышенной экспрессией гена pub человека (линия PC12-hpub) и соответствующая контрольная линия PC12-DNA3. С помощью ПЦР, сопряженной с обратной транскрипцией, была показана экспрессия трансгена в клетках линии PC12-hpub. Было показано, что как в условиях стандартного культивирования, так и в условиях трофического голодания (1% эмбриональной сыворотки коровы) клетки линии PC12-hpub не отличались по скорости роста от контрольной линии клеток PC12-DNA3. При индукции дифференцировки в этих линиях с помощью фактора роста нервов в отсутствии сыворотки было обнаружено, что число дифференцированных клеток с нейрональным фенотипом в линии PC12-hpub было существенно, примерно в 5 раз ниже, чем в контрольной линии PC12-DNA3 уже через 5 дней культивирования. Таким образом, предполагается, что суперэкспрессия гена pub человека в клетках линии РС12 феохромоцитомы крысы приводит к подавлению их дифференцировки по ней-рональному направлению при действии фактора роста нервов.
Ключевые слова: клетки феохромоцитомы крысы линии РС-12, трансфекция, пролиферация, дифферен-цировка, полимеразная цепная реакция, ген pub, фактор роста нервов (ФРН).
ВВЕДЕНИЕ
Ранее нами с помощью метода вычитающей гибридизации были получены и охарактеризованы клоны кДНК, повышенно транскрибирующиеся в ВИЧ-ассоциированных иммунобластных лимфо-мах [1, 2]. Анализ этих кДНК позволил выявить среди них наряду с ранее охарактеризованными генами (set, calpain и др.) несколько кДНК, кодирующих гены с неизвестными в то время функциями. Один из таких лимфомоспецифичных генов в дальнейшем был назван pub. Белковый продукт гена pub человека (hPub) имеет высокую степень гомологии (82%) с белком Pub других представителей млекопитающих [3].
Pub относится к семейству TRIM (tripartite motif) белков [3], для которых характерно наличие так называемого TRIM (или RBBC) мотива, состоящего из трех цинк-связывающих доменов: RING (R), B-box 1 (B1) и B-box 2 (B2), сопровождаемых coiled-coil (CC) районом [4]. На данный момент известно 37 представителей данного семейства белков. Некоторые из них вовлечены в такие биологические процессы, как регуляция транскрипции, организация
* Адресат для корреспонденции: 123182 Москва, пл. акад. Курчатова, д. 2, тел.: +7(499)196-00-14, факс: +8(499)196-02-21, e-mail: igorag@img.ras.ru.
цитоскелета, контроль клеточной пролиферации и дифференцировки [5, 6]. Функции гена hpub в организме практически не изучены. Для мышиного гомолога mpub показано, что он играет важную роль в процессах клеточной дифференцировки и оказывает существенное влияние на транскрипционную активность фактора PU.1 [3]. PU.1 относится к ETS семейству транскрипционных факторов, играет центральную роль в дифференцировке и пролиферации макрофагов и В-клеток в ходе гемопоэза, а также контролирует функциональную активность нейтрофилов [7]. Показано, что продукт гена mpub ингибирует транскрипционную активность PU.1 в гемоцитах и вследствие этого играет важную роль в пролиферации и дифференцировке миелоидных и лимфоидных клеток [3].
В наших предыдущих исследованиях функций гена hpub была использована модель эмбриональных стволовых (ЭС ) клеток мыши. Было показано, что повышенная экспрессия hpub приводила к увеличению, а пониженная экспрессия эндогенного mpub к уменьшению образования ЭС клетками эм-бриоидных тел, однако не оказывала влияния на пролиферативную активность этих клеток [8, 9]. Также было установлено,что ген hpub не обладает выраженным онкогенным потенциалом in vitro [10]. При исследовании влияния этого гена на процессы
ВЛИЯНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА pub ЧЕЛОВЕКА
79
дифференцировки в культурах ЭС клеток было обнаружено, что блокирование экспрессии гена pub приводит к усилению дифференцировки клеток в нейрональном направлении, а его суперэкспрессия, напротив, подавляет этот процесс [8, 9]. Клетки феохромоцитомы крысы линии РС-12 являются уникальной моделью изучения прцессов нейро-нальной дифференцировки, индуцированной фактором роста нервов (ФРН), in vitro [11]. Поэтому в настоящей работе была выбрана именно эта клеточная модель для дальнейшего изучения влияния гена pub на дифференцировочные процессы в нейро-нальном направлении.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Культивирование клеток феохромоцитомы крысы линии РС-12. Клетки РС-12 (получены из АССС, США) культивировали на среде RPMI 1640, содержащей 15% эмбриональной сыворотки коровы (ЭСК), 80 мкг/мл гентамицина и 2 mM L-глутамин. Клетки инкубировали в СО2-инкубаторе при 37°С и 5% СО2. Смену среды осуществляли каждые 3 дня.
Плазмиды и трансфекция клеток РС-12. В работе была использована плазмида pcDNA3 ("Promega", США) и вектор pPB, сконструированный на ее основе. Вектор pPB содержал вставку кДНК гена hpub (KIAA0129) человека (номер в базе данных "Blast 2", gi 15208662), по сайтам HindIII/NotI.
Плазмидную ДНК выделяли из трансформированных клеток E.coli XL1 на колонках с помощью набора реактивов фирмы "Qiagen", США. Для трансфекции клеток плазмидную ДНК после переосаждения растворяли в стерильной воде до конечной концентрации 2 мкг/мкл.
Введение плазмидной ДНК в клетки осуществляли с помощью реагента Унифектин-56тм ("Uni-fect. The transfection group", Россия) по стандартной методике, описанной производителем. Для транс-фекции использовали плазмиды pcDNA3 (контроль) и pPB в концентрации 6 мкг на 1 млн. клеток. Селекцию начинали на 2-е сут после посева добавлением в среду антибиотика G418 (500 мкг/мл). Смену селективной среды проводили каждые 3— 4 сут. Поликлональные культуры каждого варианта трансфекции снимали с чашек на 14-й день селекции в виде суммарного пула G418-резистентных клонов. Число клеток и их пролиферацию оценивали прямым подсчетом живых клеток под микроскопом Olympus СКХ41 ("Olympus", Япония) в камере Горяева.
Индукция дифференцировки стабильно трансфи-цированных клеток линии РС-12 под действием
ФРН. Полученные после трансфекции и последующей селекции клетки рассевали на 24-х луночные плашки, предварительно обработанные полилизином (poly-D-Lysine hydrobromide), по 12.5 тыс. на лунку. Клетки культивировали в бессывороточной
среде RPMI, содержащей 80 мкг/мл гентамицина 2 mM L-глутамин, с одновременным добавлением ФРН ("ICN Biomedicals" США.) до конечной концентрации 100 нг/мл. Подсчет дифференцированных клеток проводили на 9-e и 15-e сут культивирования под микроскопом (Olympus CKX4, Japan).
Выделение тотальной РНК и проведение обратной транскрипции. Тотальную РНК из недифференцированных и дифференциированных клеток выделяли методом фенол-хлороформной экстракции с использованием набора YellowSolve ("Clonogen", Россия), следуя рекомендациям производителя. Процедуру обратной транскрипции проводили с использованием набора фирмы "Силекс" (Россия) согласно протоколу и рекомендациям производителя. Синтез кДНК проводили на 0.5 мкг тотальной РНК в течение 1 ч при 37°С в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 0.05 мкг случайных гексапрай-меров и 100 ед. обратной транскриптазы MMLV (molo^y murine leukemia virus). После остановки реакции (инкубация 10 мин при 70°С) образцы кДНК хранили при —20°С.
Полимеразная цепная реакция. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в 25 мкл реакционной смеси, состоящей из Taq-буфера, 1.5 мМ смеси dNTP, 1.25 ед. "colored" Taq полимеразы ("Синтол", Россия), 0.5 мкл образца кДНК и 10 пмоль каждого праймера. Следующие праймеры использовали для амплификации гена hpub: 5'-GCAGCAGCACATTGACAACA-3'-s, 5'-TCCAC-GAGGCCCTTAAAGAA-3'-as. Условия амплификации: температура отжига 60°С, число циклов — 30. Размер продукта реакции составлял 382 п.н.
Продукты ПЦР разделяли в 1.5%-ном агарозном геле с визуализацией с помощью бромистого эти-дия и далее анализировали с помощью системы BioDocAnalyze ("Biometra", Германия).
Статистическая обработка результатов экспериментов. Результаты обрабатывались с помощью программы Jandel Scientific SigmaPlot для Windows и Origin для Windows. На графиках представлены средние значения с учетом стандартной ошибки. Определение достоверности различий проводилось с помощью теста multiway ANOVA. Достоверными считались значимости различий при p < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Для исследование влияния гена hpub на процессы клеточной дифференцировки была использована линия клеток РС-12 феохромоцитомы крысы.
Хорошо известно, что клетки линии РС-12 являются удобной и широко используемой моделью для изучения процессов нейрональной дифференци-ровки и клеточной гибели, поскольку под действием фактора роста нервов (ФРН) они способны дифференцироваться в нейроны in vitro [11].
382 п.н.
1
Рис. 1. Экспрессия гена крыЪ в трансфицированных недифференцированных и дифференцированных линиях клеток РС-12.
1 - клетки РС12-ИРиЪ, 2 - клетки РС12^КА3, 3 -дифференцированные клетки РС12-ИРиЪ, 4 — дифференцированные клетки РС12^КА3, 5 — положительный контроль (плазмида рРВ, несущая вставку кДНК гена крыЪ), 6 — отрицательный контроль — смесь РНК, выделенных из трансфицированных клеток.
50
40
х
о 30 ё
о 20
ч
о
и
&
10
и
Была проведена трансфекция клеток РС-12 с помощью липофектамина векторами рсЭМА3 (контроль) и рРВ (несущим кДНК гена крыЪ). В результате трансфекции и последующей селекции на антибиотике 0418 были получены две поликло-нальные линии клеток:
1) линия клеток РС12-ЬриЪ (несущая трансген, крыЪ),
2) линия клеток РС12-ЭМА3 (контроль).
С помощью метода обратной транскрипции, сопряженн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.