ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 5, с. 658-665
УДК 581.1
ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННОГО АММОНИЯ НА ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОЕ ВЫДЕЛЕНИЕ О2 И УЛЬТРАСТРУКТУРНУЮ ОРГАНИЗАЦИЮ КЛЕТОК КАЛЛУСА СОИ
© 2004 г. А. П. Смолов, В. Г. Ладыгин, Г. А. Семенова*
Институт фундаментальных проблем биологии Российской академии наук, Пущино, Московская обл. *Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук, Пущино,
Московская обл.
Поступила в редакцию 10.02.2004 г.
Исследовали влияние экзогенного аммония на функциональную активность (выделение 02) и структурную организацию клеток миксотрофного каллуса сои (Glycine max L.). Присутствие аммония в составе питательной среды повышало содержание хлорофилла. При этом усиливалась скорость фотосинтетического выделения 02 в расчете на единицу биомассы, но снижалась - в расчете на единицу содержавшегося в клетках хлорофилла. Наличие аммония в составе питательной среды способствовало как формированию белок-синтезирующей системы клетки, которое проявлялось в увеличении числа рибосомальных структур, так и непосредственно усиливало белковую направленность обмена, обнаруживаемую по увеличению мембранной системы хлоропластов, усилению электронной плотности матрикса митохондрий и цитоплазмы миксотрофных клеток. Обсуждается возможная роль аммония (несубстратная) при формировании функциональных структур растительной клетки.
Glycine max - каллус - аммоний - выделение О2 - органеллы - ультраструктура
При культивировании растительных клеток in vitro в структуре хлоропластов происходят изменения, связанные с редукцией гран тилакоидной системы [1]. Считается, что эти изменения обусловлены присутствием в питательной среде углеводных компонентов [2]. Снижение концентрации сахаров (с 3 до 0.5%) или переход на неорганический источник углерода, С02 воздуха, приводит вновь к образованию гран в хлороплас-тах клеток культуры. Известно также, что гра-нальная организация ламеллярной структуры хлоропластов прямо связана с наличием в них пигмент-белковых комплексов ФС II [3].
Другой компонент питательной среды, аммоний, также способен изменять содержание хлорофилла в клетках каллуса [4]. Более того, присутствие в среде аммония приводило к повышению отношения скорости фотосинтеза к скорости темнового дыхания [4], что также свидельствова-ло о перестройке метаболического обмена в пользу фототрофного типа питания клеток. Уве-
Адрес для корреспонденции: Смолов Александр Петрович. 142290 Московская обл., Пущино. Институт фундаментальных проблем биологии РАН. Электронная почта: smolov@mail.ru
личение содержания хлорофилла и усиление доли фототрофного типа питания в метаболическом обмене клеток могло быть связано с совершенствованием молекулярной структуры фотосинтетического аппарата под действием экзогенного аммония.
Анализ состава пигмент-белковых комплексов хлоропластов каллуса сои, выращенного на содержащей аммоний и безаммонийной среде не показал существенных качественных различий между ними, но четко обозначил количественные отличия в содержании пигментов (хлорофиллов и каротиноидов) и их комплексов с белками в составе ССК и ФС I [5].
Следовательно, становилось понятным, что клетка выполняет свою "программу" по формированию фотосинтезирующих структур вне зависимости от присутствия или отсутствия в среде аммония, а аммоний мог являться лишь фактором, способствующим выполнению этой "программы".
Целью настоящей работы было исследование влияния экзогенного аммония на фотосинтетическое выделение 02 и структурную организацию хлоропластов и других клеточных органелл у культивируемого in vitro каллуса сои.
120 г
§100
о
л
£ «
О *
5*
80
л и
о &
о ч о
н
м
«
н к
о ч о и 3 га
(a)
2г
60
40~
120
н J
о &
о ч
I* и
ч о £ м £
80
60
40~ 0~-
1
се ч ч
s ч .ft ^
1
& 2
о
ч *
« о
н к
се * „
и о О
■х 1
10 20 30
Время культивирования, сут
40
10 20 30 40
Время культивирования, сут
Рис. 1. Изменение скорости фотосинтетического выделения О2 каллуса сои, выращенного на средах А (1) и Б (2) в процессе культивирования. а - расчет на единицу биомассы, б - расчет на единицу хлорофилла.
МЕТОДИКА
Объектом исследования служила миксотроф-ная каллусная культура сои (Glycine max L.), которую выращивали на двух модифицированных питательных средах МС: среде А и среде Б.
В среде А содержание аммония и нитрата соответственно равнялось 7 и 26 мМ. В среде Б содержался только нитрат - 32 мМ. Такие количества азот-содержащих минеральных компонентов позволили выровнять обе среды по азотному показателю (около 460 мг азота на 1 л среды). В состав обеих сред не включали органический источник азота - гидролизат казеина. Остальные компоненты питательной среды сохранялись на уровне стандартной среды МС [6].
Культуру выращивали в 250-миллилитровых конических колбах с 50 мл питательной среды. Условия культивирования: 16 ч свет + 8 ч темнота, интенсивность света - 4-5 клк, температура -27°С. Продолжительность культивирования - 3540 сут.
Рис. 2. Изменение содержания хлорофилла в клетках каллуса сои, выращенного на средах А (1) и Б (2) в процессе культивирования.
Скорость фотосинтетического выделения 02 клетками каллуса в пассаже определяли манометрически [7]; при исследовании влияния интенсивности света на скорость фотосинтетического выделения 02 в период максимальной фотосинтетической активности клеток каллуса - потенцио-метрическим методом с помощью электрода Кларка [8, с. 69].
Содержание хлорофилла в каллусной ткани определяли по Arnon [9].
Для электронно-микроскопических исследований кусочки каллуса фиксировали в 2.5%-ном растворе глутарового альдегида с постфиксацией в 1%-ном растворе тетраоксида осмия на фосфатном буфере pH 7.4. Дальнейшие процедуры подготовки образцов: обезвоживание, полимеризацию, получение и контрастирование срезов, проводили по стандартным методам [10].
Результаты представляют собой типичные показатели одного из трех биологических экспериментов.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Фотосинтетическая активность клеток каллуса сои
Измерения скорости фотосинтетического выделения 02 показали, что каллусные клетки, выращенные на среде А, выделяли больше 02 на единицу сухой массы, чем клетки, выращенные на безаммонийной среде Б (рис. 1а). Однако присутствие экзогенного аммония приводило к значительному увеличению содержания хлорофилла в единице биомассы (рис. 2). Поэтому при расчете скорости фотосинтетического выделения 02 на единицу содержащегося в клетках хлорофилла
2
1
1
2
0
2
Рис. 3. Зависимость скорости фотосинтетического выделения О2 от интенсивности освещения клеток каллуса сои, выращенного на средах А (1) и Б (2) в период максимальной фотосинтетической активности (20-30 сут).
а - расчет на единицу биомассы, б - расчет на единицу хлорофилла.
эти показатели были выше у клеток, выращенных на безаммонийной среде (среда Б), чем у клеток, выращенных на аммоний-содержащей среде (среда А) (рис. 16). Таким образом, в зависимости от способа оценки скорости выделения О2 миксо-трофной клеткой (в расчете на единицу биомассы или единицу хлорофилла, ср. рис.1а и 1б) эффект экзогенного аммония носил прямо противоположный характер.
Следует отметить, что рост этих культур проходил при ненасыщающей интенсивности света (4-5 клк).
В зависимости от интенсивности падающего света соотношение скоростей фотосинтетического выделения О2 (как по отношению к единице биомассы, так и относительно единицы содержащегося в клетках хлорофилла) между различными фотосинтезирующими объектами может меняться. Это происходит тогда, когда у одного объекта угол наклона линейного участка световой
кривой выше, а плато насыщения и насыщающая интенсивность света ниже, чем у другого объекта.
Для проверки этой версии мы провели измерения скорости выделения О2 в широком диапазоне интенсивностей светового потока (от 1 до 20 клк) (рис. 3). Полученные результаты показали, что световое насыщение скоростей фотосинтеза наступало уже при интенсивности света равной 10 клк для обоих вариантов каллусных клеток. Однако скорость выделения О2 в расчете на единицу хлорофилла была выше у клеток, выращенных на безаммонийной среде (среда Б), при всех испытанных интенсивностях света (рис. 36), а при расчете на единицу биомассы - выше на среде А (рис. 3а). Кроме того, у клеток, выращенных на безаммонийной среде (среда Б), при пересчете на единицу хлорофилла, был больше и угол наклона начального участка световой кривой (рис. 36), что свидетельствует о более эффективном использовании энергии света хлоропластами клеток, выращенными в отсутствие аммония. Возраст клеток (стадия роста) не влиял на эту зависимость, она сохранялась в течение всего ростового цикла (данные не приведены).
Различия в углах наклона линейных участков световых кривых на рис. 3 а и 36 могут быть вызваны тем, что развитие пластид в клетках (в нашем случае оцениваемое по содержанию хлорофилла) не происходит одновременно с ростом биомассы самой клетки. Снижение скорости фотосинтетического выделения О2 в расчете на единицу хлорофилла у клеток, выращенных на аммоний-содержащей среде (среда А), по сравнению с этим показателем у клеток, выращенных на безаммонийной среде (среда Б), мы связываем с экранирующей способностью больших количеств хлорофилла.
Ультраструктура клеток каллуса сои
Состояние фотосинтезирующей клетки и/или органеллы может быть оценено при исследовании ее ультраструктурной организации.
У клеток, выращенных на безаммонийной среде (среда Б) (рис. 46), цитоплазма разреженная, электронно-прозрачная, содержит мало рибосом (10-20 шт/мкм2 площади среза). На микрофотографиях видны липидные глобулы и цистерны эндоплазматического ретикулума. У митохондрий матрикс также неплотный, кристы слабо развиты. Пластиды большие, округлые, с крупными крахмальными зернами и слабо развитой системой тилакоидов. Встречаются пластиды огромных размеров неправильной формы (до 30 мкм) с узкой перемычкой. Клетки миксотрофной культуры сои, выращенные на среде без аммония, содержат хлоропласты с сильно редуцированной мембранной системой (рис. 5). Структура их ско-
Рис. 4. Ультраструктура цитоп
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.