ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2014, том 61, № 1, с. 69-76
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННОГО СПЕРМИНА НА ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ РАСТЕНИЙ Thellungiella salsuginea
© 2014 г. Д. В. Королькова*, Н. Л. Радюкина*, Т. Н. Сошинкова*, С. Мапелли**, Вл. В. Кузнецов*
*Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений
им. К.А. Тимирязева РАН, Москва **Институт сельскохозяйственной биологии и биотехнологии, Милан, Италия Поступила в редакцию 23.05.2013 г.
Исследовали влияние экзогенного спермина (Спм) на содержание полиаминов (ПА) и активность антиоксидантных ферментов в корнях и листьях растений Thellungiella salsuginea (Pall.) O.E. Schulz, выращенных в оптимальных условиях, а также идентифицировали и анализировали интенсивность экспрессии генов трех изоформ аскорбатпероксидазы (АПО; APX1, APX2, APX4) и генов ключевых ферментов метаболизма пролина (Про; P5CS1, 1P5CD). Растения в возрасте 6 недель обрабатывали Спм (1 и 2 мМ) и ингибитором активности полиаминооксидазы - М,М-(2-гидроксиэтил)гидрази-ном (HEH; 1 и 2 мМ), по отдельности или совместно, добавляя указанные соединения в питательную среду. Установили различия ответной реакции корней и листьев на действие экзогенного Спм. В листьях снижалось содержание ПА за счет уменьшения содержания спермидина (Спд), тогда как в корнях — увеличивался общий пул ПА за счет накопления путресцина (Пут) и Спд. Обработка экзогенным Спм повышала активность полиаминоксидазы (ПАО) в корнях, но не в листьях; HEH снимал наблюдаемое повышение, но при этом внутриклеточная концентрация Спм существенно не изменялась. Предположили, что экзогенный Спм, с одной стороны, ингибировал биосинтез внутриклеточного Спм, а с другой, стимулировал обратное превращение Спм в Спд и, далее, в Пут за счет активации одной из изоформ ПАО. Обработка растений Спм не сопровождалась заметной активацией в корнях разлагающих пероксид водорода ферментов: АПО, пероксидазы (за исключением пероксидазы II) и каталазы, но при этом в 2 раза повышалась активность Cu/Zn-СОД и снижалась активность Mn-СОД. В листьях отмечали небольшую активацию пероксидазы (I и III), инги-бирование активности Cu/Zn- и Mn-СОД, дифференциальную экспрессию во времени генов трех изоформ АПО и повышение интенсивности экспрессии генов ключевых ферментов метаболизма Про. Вместе с тем, уровень МДА ни в листьях, ни в корнях не возрастал. Это свидетельствует о том, что Спм при обработке растений Th. salsuginea в оптимальных условиях выращивания не стимулировал генерацию АФК и не обладал прооксидантным действием.
Ключевые слова: Thellungiella salsuginea — полиамины — полиаминоксидаза — система антиоксидант-ной защиты — окислительный стресс
DOI: 10.7868/S0015330314010072
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время известно, что полиамины (ПА) путресцинового ряда — путресцин (Пут), спермидин (Спд) и спермин (Спм) — вовлечены в регуляцию многих физиологических процессов, в
Сокращения: АПО — аскорбатпероксидаза; ДАО — диами-ноксидаза; Кат — каталаза; ПА - полиамины; Про — пролин; Спм — спермин; Спд — спермидин; СОД — супероксиддис-мутаза; ПАО — полиаминоксидаза; ПДГ — пролиндегидро-геназа; Пут — путресцин; НЕН - К,К-(2-гидроксиэтил)гад-разин (от B-hydroxyethyl hydrazine).
Адрес для корреспонденции: Королькова Диана Валерьевна. 127276 Москва, ул. Ботаническая, 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Электронная почта: korolkova_d_v@mail.ru
том числе, и в адаптацию растений к действию стрессоров различной физической природы [1— 4]. В литературе накоплен обширный фактический материал, согласно которому ПА вовлекаются в развитие стресс-толерантности у растений [1, 3]. В ряде работ показано, что обработка растений экзогенными ПА сопровождается снижением уровня АФК и стимуляцией экспрессии генов антиоксидантных ферментов [1, 2, 5]. Отсюда следует, что одним из механизмов стресс-защитного действия ПА является регуляция уровня АФК и функционирования клеточной антиокси-дантной системы.
Для проверки этой гипотезы представлялось целесообразным исследовать реакцию растений на действие экзогенных ПА, в частности Спм, в оптимальных условиях выращивания. С этой точки зрения, наиболее важным представляется изучение влияния экзогенного Спм на функционирование антиоксидантных ферментов и содержание ПА, также обладающих антиоксидантными свойствами.
Внутриклеточный уровень того или иного ПА определяется соотношением скоростей их синтеза и распада. Рассматривая влияние ПА на окислительно-восстановительный статус клетки, необходимо, прежде всего, обращать внимание на реакции катаболизма ПА, которые контролируются полиаминоксидазой (ПАО) или диаминокси-дазой (ДАО) [1]. В связи с этим, следует отметить, что при катаболизме ПА с участием ПАО и ДАО образуется пероксид водорода, который выступает не только в качестве сигнальной молекулы, но и является одной из активных форм кислорода (АФК), повышение концентрации которой может нарушать равновесие между прооксидантными и антиокси-дантными клеточными системами.
Другой стресс-протекторный метаболит -пролин (Про), при обработке им растений проявлял как антиоксидантные, так и прооксидантные свойства [6—9]. Причем при обработке растений экзогенным Про в нормальных условиях он действовал, прежде всего, как прооксидант, тогда как в условиях стресса — как антиоксидант [9].
Вопрос о том, какой эффект оказывают экзогенные ПА, в частности Спм, на окислительно-восстановительный статус растения, остается в настоящее время открытым. Для ответа на этот вопрос мы исследовали влияние экзогенного Спм на уровень окислительного стресса, который оценивали по содержанию МДА, и на уровень активности антиоксидантной системы (содержание ПА и Про, активности СОД, аскорбатпероксида-зы (АПО), каталазы (Кат), пероксидаз) растений Thellungiella salsuginea в оптимальных условиях роста, что и являлось целью настоящей работы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве объекта исследования были использованы 6-недельные растения Thellungiella salsuginea (Pall.) O.E. Schulz (экотип Shandong). Семена проращивали в перлите, после чего проростки в возрасте 3 недель переносили на питательную среду Кнопа с микроэлементами по Хо-гланду. Растения культивировали в камере фитотрона при 12-часовом световом периоде с использованием ламп Philips (F36W/54) при интенсивности светового потока в диапазоне ФАР 250 ± 50 мкмоль фотонов/(м2 с). Температура воз-
духа составляла 22 ± 3/16 ± 3°С (день/ночь); относительная влажность воздуха — 55/70% (день/ночь).
Взрослые растения (6-недельного возраста в стадии розетки) переносили на питательную среду, содержавшую спермин (Спм; 1 или 2 мМ) или ингибитор полиаминоксидазы - ^^(2-гидрок-сиэтил)гидразин (НЕН от B-hydroxyethyl hydrazine; 1 или 2 мМ), или оба эти соединения вместе. Контрольные растения выращивали на исходной питательной среде. Через 12 ч культивирования растений в указанных условиях отбирали пробы листьев и корней; материал фиксировали жидким азотом и хранили при -70°С до проведения биохимических анализов.
Для определения содержания свободных полиаминов (ПА) проводили количественный анализ их дансил-производных с помощью ВЭЖХ по методу, описанному ранее [10].
Содержание малонового диальдегида (МДА) определяли спектрофотометрически по образованию окрашенного комплекса с тиобарбитуро-вой кислотой при нагревании (Genesis-10 UV, "Thermo Electron Corporation", США) [11].
Измерение общей активности супероксиддис-мутазы (СОД, КФ 1.15.1.1) проводили по методу Beauchamp и Fridovich [12], основанному на ин-гибировании СОД процесса фотохимического восстановления нитросинего тетразолия до фор-мазана.
Активность аскорбатпероксидазы (АПО, КФ 1.11.1.11) определяли спектрофотометрически по скорости разрушения аскорбиновой кислоты [13].
Определение активности каталазы (КАТ, КФ 1.11.1.6) проводили по методу Maehly и ChHnce [14].
Активность пролиндегидрогеназы (ПДГ, КФ 1.5.99.8) определяли спектрофотометрически по изменению концентрации восстановленного НАД [15].
Экстракцию свободного пролина (Про) и его определение проводили по методу Bates с соавт. [16].
Содержание белка в полученных ферментных препаратах определяли по методу Esen [17].
Электрофорез белковой фракции (ферментные препараты СОД и АПО) в неденатурирую-щих условиях проводили в полиакриламидном геле по стандартной методике [18, 19] на приборе Mini protean 3 ("Bio-Rad", США).
Интенсивность экспрессии генов изоформ ас-корбатпероксидазы (АПО; APX1, APX2, APX 4) и генов ключевых ферментов метаболизма пролина (Про; P5CS1 и 1P5CD) оценивали методом ОТ-ПЦР с использованием специфических праймеров, сконструированных в программной среде Vector NTI и AliginX ("Invirogen", США), программы Vector NTI и базы данных www.ncbi.nlm.nih.gov. В качестве внутреннего контроля при проведении ОТ-ПЦР использовали уровень транскриптов ге-
Рис. 1. Содержание свободных полиаминов в растениях ТН. закщтва через 12 ч после обработки Спм, ингибитором ПАО (НЕН) и после их совместной обработки.
а — содержание ПА в листьях, б — содержание ПА в корнях. 1 - контроль, 2 — 1 мМ Спм, 3 — 2 мМ Спм, 4 - 1 мМ НЕН, 5 - 2 мМ НЕН, 6 - 1 мМ Спм совместно с 1 мМ НЕН, 7 - 2 мМ Спм совместно с 2 мМ НЕН. 0 - Спд, □ - Спм, ■ - Пут.
на актина (Act2). В качестве праймеров использовали следующие последовательности нуклеоти-дов: P5CS1 прямой - 5'-CgCTTCCTCAgC-CgATTT-3'; P5CS1 обратный - 5'-gTCggAATCAgTgAAgCAgCgTg-3'; 1P5CD прямой -5'-gAggCgAACCCACggATgACC-3'; 1P5CD обратный - 5'-TggCTCCAAAgCTCCgTAgATTgA-3'; APX1 прямой - 5'-ggTCCgACTCgCATggCACT-3'; APX1 обратный - 5'-CCTCTggAggTggTTggggCT-3'; APX 2 прямой - 5'-TgCATggCACTCggCTgggA-3'; APX 2 обратный - 5'-ACgCTCCTTgTggCACCgAC-3'; APX4 прямой - 5'-CCggCACCgCCATTggAATgg-3'; APX4 обратный - 5'-gAgCgACTTgTgggTCgCTAgC-3'.
РНК выделяли из растительного материала фенольным методом [20]. Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически на спектрофотометре ND-1000 ("Nano Drop Technologies", США). Для проведения обратной транскрипции использовали Reverse Transcriptase MV ("Fermentas"), согласно протоколу производителя. П
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.