ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2014, том 61, № 3, с. 367-375
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННОЙ ЖАСМОНОВОЙ КИСЛОТЫ НА ПРО-/АНТИОКСИДАНТНУЮ СИСТЕМУ КОЛЕОПТИЛЕЙ ПШЕНИЦЫ В СВЯЗИ С УСТОЙЧИВОСТЬЮ К ГИПЕРТЕРМИИ © 2014 г. Ю. В. Карпец, Ю. Е. Колупаев, А. А. Луговая, А. И. Обозный
Харьковский национальный аграрный университет им. В.В. Докучаева, Харьков, Украина
Поступила в редакцию 27.01.2013 г.
Исследовали влияние экзогенной жасмоновой кислоты (ЖАК) на генерациюколеоптилями пшеницы (ТпНсит авзйуыт Ь., сорт Элегия) супероксидного анион-радикала (02 ), активность внеклеточной пероксидазы, ферментативные и неферментативные компоненты антиоксидантной системы. В течение первого часа после начала обработки колеоптилей ЖАК (1 мкМ) наблюдали усиление генерации супероксидного анион-радикала и повышение активности внеклеточной пероксидазы, в течение последующих 23 ч инкубации эти эффекты постепенно снижались. Вызываемое ЖАК усиление генерации О2 частично подавлялось обработкой колеоптилей как ингибитором пероксидазы салицилгидроксамовой кислотой, так и ингибитором НАДФ-Н-оксидазы ими-дазолом, а также хелатором кальция ЭГТА. Под влиянием ЖАК в колеоптилях пшеницы происходило повышение активности антиоксидантных ферментов — супероксиддисмутазы, каталазы, аскорбатпероксидазы и растворимой гваяколпероксидазы. Обработка ЖАК вызывала повышение устойчивости колеоптилей к повреждающему прогреву (10 мин при 43°С), способствовала поддержанию пула ферментативных и неферментативных антиоксидантов. При этом ингибиторы НАДФ-Н-оксидазы и пероксидазы, а также хелатор кальция нивелировали положительное влияние ЖАК на теплоустойчивость колеоптилей. Обсуждается роль изменений про-/антиоксидантного равновесия в растительных тканях в реализации стресс-протекторных эффектов ЖАК.
Ключевые слова: Тпйсит ав5йуит — жасмоновая кислота — супероксидный анион-радикал — пероксидза — НАДФН-оксидаза — кальций — антиоксидантная система — теплоустойчивость
БО1: 10.7868/80015330314020067
ВВЕДЕНИЕ
Жасмоновая кислота (ЖАК) является одним из ключевых "стрессовых" гормонов растений. Особенно важной считается роль ЖАК в запуске индуцированной системной устойчивости растений к патогенам (в первую очередь, к некротро-фам) и насекомым-вредителям [1]. Такие эффекты ЖАК связаны с ее участием в активации генов ингибиторов протеаз, ферментов флавоноидного биосинтеза и некоторых антигрибных белков [2].
Вместе с тем, в последние годы появился довольно большой массив данных, свидетельствующих об участии эндогенной и экзогенной ЖАК в
Сокращения: АПО - аскорбатпероксидаза; ГПО - гваяколпе-роксидаза; ДФПГ — 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил; ЖАК — жасмоновая кислота; КАТ - каталаза; НСТ — нитросиний тет-разолий; ОАА — общая антиоксидантная активность; ПО - пе-роксидаза; СГК — салицилгидроксамовая кислота; СОД — су-пероксиддисмутаза.
Адрес для корреспонденции: Колупаев Юрий Евгеньевич. Украина, 62483 Харьков, п/о "Коммунист-1". Харьковский национальный аграрный университет им. В.В. Докучаева. Электронная почта: plant_biology@mail.ru
регуляции устойчивости растений к абиотическим стрессорам [3—6].
Участники трансдукции сигнала ЖАК в генетический аппарат клетки выяснены не полностью. Одним из ключевых компонентов жасмо-натного сигналинга считается белок С011 (от сог-опайуе ^ешШуе!), который необходим для удаления белков-репрессоров транскрипт-факторов генов сигналинга ЖАК [7]. В то же время, имеются сведения, указывающие на роль активных форм кислорода (АФК) в жасмонатном сиг-налинге [8].
Полагают, что некоторые эффекты ЖАК, в частности, ее способность индуцировать закрытие устьиц [9], старение листьев [10] связаны с активацией НАДФ-Н-оксидазы, поскольку данные эффекты нивелировались ингибиторами этого фермента. С другой стороны, есть косвенные указания на участие пероксидазы в образовании АФК, индуцируемом ЖАК [10]. Показано существенное повышение активности слабо связанной с плазматической мембраной пероксидазы в корнях проростков кукурузы при действии мети-
лжасмоната или патогенных элиситоров [11]. Однако неизвестно, участвуют ли формы перокси-дазы, генерирующие АФК, в процессах индуцирования устойчивости растений к абиотическим стрессорам экзогенной ЖАК.
Имеются данные о повышении активности ан-тиоксидантных ферментов под действием ЖАК, в том числе и в условиях действия стрессоров [6, 12]. В то же время, экспериментальных доказательств причинно-следственной связи между способностью ЖАК индуцировать образование АФК и повышать устойчивость растений к абиотическим стрессорам недостаточно.
Целью настоящей работы явилось установление связи между влиянием ЖАК на про-/антиок-сидантное равновесие в клетках растений и их теплоустойчивость. Кроме того, в задачу работы входило выяснение вероятных источников АФК -ферментов, активируемых ЖАК. Исследования проводили на колеоптилях пшеницы, которые являются удобной моделью для изучения генерации АФК и индуцирования защитных систем клеток экзогенными соединениями [13].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для работы использовали отрезки колеопти-лей (базальные части), отделенные от четырехсу-точных этиолированных проростков пшеницы (ТгШеыш агзИуыт Ь.) сорта Элегия. Подготовка растительного материала описана нами ранее [13]. После препарирования колеоптили выдерживали не менее 2 ч на стерильной дистиллированной воде, затем на 14 ч переносили на просте-рилизованный 2% раствор сахарозы с добавлением пенициллина (№-соль, 100000 ед./л) для снятия последствий раневого воздействия [13]. Отрезки колеоптилей контрольного варианта продолжали инкубировать на 2% растворе сахарозы с добавлением пенициллина. В среду соответствующих опытных вариантов добавляли ЖАК в конечной концентрации 1 мкМ. Предварительно ЖАК растворяли в небольшом объеме этанола. В среду вариантов без ЖАК вносили эквивалентное количество этанола. Оптимальную концентрацию ЖАК, в наибольшей степени повышающую теплоустойчивость колеоптилей, выбирали на основании результатов предварительных опытов (результаты не приводятся). Обработку ко-леоптилей ЖАК проводили в течение 24 ч.
В соответствующих сериях экспериментов ко-леоптили в течение 26 ч обрабатывали антиокси-дантом ионолом (бутилгидрокситолуол, 5 мкМ), ингибитором НАДФН-оксидазы имидазолом (1 мкМ), ингибитором пероксидазы салицилгид-роксамовой кислотой (СГК, 500 мкМ) [13], хела-тором внеклеточного кальция ЭГТА (50 мкМ). Концентрации указанных соединений выбирали на основании предварительных опытов. В этих опытах было выявлено, что инкубация колеопти-лей в течение первых 2 ч на среде с более высоки-
ми концентрациями ингибиторов АФК-генери-рующих ферментов (5 мкМ имидазола и 1 мМ СГК) вызывала снижение генерации супероксидного анион-радикала колеоптилями на 23 и 17% соответственно. Однако после инкубации ко-леоптилей в течение суток на растворах ингибиторов в таких концентрациях заметно снижалась их теплоустойчивость, кроме того, у части отрезков, которые не подвергались прогреву, нарушался тургор (результаты не приводятся). Иными словами, ингибиторы проявляли неспецифическое токсическое действие, что не позволяло использовать их в повышенных концентрациях. Более высокие концентрации антиоксиданта ионо-ла (20 мкМ) и хелатора кальция ЭГТА (200 мкМ) на 32 и 19%, соответственно, угнетали генерацию супероксидного анион-радикала отрезками и при этом вызывали существенное снижение теплоустойчивости колеоптилей (результаты не приводятся). В дальнейших экспериментах использовали концентрации эффекторов, которые сами по себе не оказывали заметного токсического действия на колеоптили, достоверно не влияли на их теплоустойчивость, но снижали положительное действие ЖАК на выживание отрезков и модифицировали изучаемые биохимические эффекты. В вариантах с комбинированной обработкой указанные эффекторы добавляли в основную среду инкубации колеоптилей (2% сахарозу с пенициллином) за 2 ч до введения в нее ЖАК.
После инкубации колеоптилей на растворах исследуемых соединений часть отрезков каждого варианта подвергали потенциально летальному прогреву в водном ультратермостате в стерильной дистиллированной воде при температуре 43 ± ± 0.1°С в течение 10 мин. Затем отрезки помещали в чашки Петри с простерилизованным 2% раствором сахарозы с добавлением пенициллина. В течение первых суток видимые повреждения колеоптилей не проявлялись. Через 2 суток после прогрева оценивали повреждения колеоптилей по признакам инфильтрирования тканей и потере тургора [13].
Выделение супероксидных анион-радикалов (02 ) из отрезков колеоптилей во внешний раствор определяли по восстановлению нитросинего тетразолия (НСТ) с превращением его в форма-зан. По истечении времени инкубации колеоптилей на растворах ЖАК и (или) других эффекторов по 15 отрезков осторожно переносили на фильтр для удаления излишков инкубационной среды и затем - в пробирки с 5 мл 0.1 М К,№-фосфатного буфера (рН 7.6), содержащего 0.05% НСТ, 10 мкМ ЭДТА и 0.1% Тритона Х-100. Пробы в течение 30 мин встряхивали на шейкере-качалке (120 об./мин), после чего определяли оптическую плотность инкубационного раствора при длине волны 530 нм [13]. Для проверки специфичности
определяемой генерации О^ в специальных опытах в пробы добавляли супероксиддисмутазу
(СОД, 50 ед./мл). СОД вызывала снижение образования формазана не менее, чем на 90%. В связи с этим, считали, что количество восстановленного НСТ определяется генерацией О.-. Суперок-сид-продуцирующую активность оценивали как изменение оптической плотности реакционной смеси за единицу времени инкубации в расчете на один отрезок. За 100% принимали величину в контрольном варианте в начальной точке наблюдений.
При определении активности внеклеточной пероксидазы (ПО) по истечении времени инкубации колеоптилей на растворах эффекторов по 15 отрезков переносили на фильтр для удаления излишков инкубационной среды и помещали в пробирки с 5 мл 0.06 М К,№-фосфатного буфера (рН 6.2) с добавлением 0.1% Тритона Х-100 для 30-минутного встряхивания на шейкере-качалке (120 об./мин) [13]. В качестве субстрата использовали 0.15% Н202, а в качестве восстановителя — 0.7% гвая
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.