ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2011, том 58, № 5, с. 673-680
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННЫХ ПОЛИАМИНОВ НА СОДЕРЖАНИЕ ПРОЛИНА И ЭНДОГЕННЫХ СВОБОДНЫХ И КОНЪЮГИРОВАННЫХ ПОЛИАМИНОВ РАСТЕНИЙ ШАЛФЕЯ В УСЛОВИЯХ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА © 2011 г. Н. Л. Радюкина*, ***, А. В. Шашукова*, С. Мапелли**, Т. Н. ^шинкова*
*Учреждение Российской академии наук Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва **Институт сельскохозяйственной биологии и биотехнологии, Милан, Италия ***Российский университет дружбы народов, Москва Поступила в редакцию 21.02.2011 г.
Растения шалфея (Salvia officinalis L.) на стадии 4—5 настоящих листьев, выращенные в водной культуре, обрабатывали паракватом (PQ) (1 мл раствора, содержавшего 0.1 мкМ PQ в 0.05% Твин-80), экзогенными путресцином (Пут), спермидином (Спд) и спермином (Спм) (0.5 мМ в 0.05% Твин-80) в течение 6, 12, 24, 36, 48 ч, или совместно полиаминами (ПА) и PQ. В нормальных условиях выращивания обработка индивидуальными ПА не вызывала изменений в содержании свободного про-лина. При действии PQ в условиях окислительного стресса окисление пролина и свободных ПА активными формами кислорода приводило к их расходованию и вызывало необходимость восстановления содержания свободных ПА за счет гидролиза нерастворимых конъюгатов. В отличие от действия лишь одного PQ совместная обработка растений ПА + PQ при перенесении на свет сопровождалась повышением содержания пролина. Обработка Пут совместно с PQ вызывала увеличение содержания внутриклеточного Пут и его растворимых и нерастворимых конъюгатов. Такое же действие оказывали экзогенные Спд и Спм при обработке совместно с PQ на содержание внутриклеточных растворимых и нерастворимых конъюгатов Спд и Спм. При использовании этих высокомолекулярных ПА возрастала активность полиаминоксидазы и наблюдалось образование диамино-пропана. Можно предположить, что для восстановления гомеостаза высокомолекулярных ПА индуцируется их деградация полиаминоксидазой или образование нерастворимых конъюгатов. Таким образом, количество свободной и конъюгированной форм индивидуальных ПА строго регулируется и поддерживается на определенном уровне. Снижение содержания свободной формы индивидуального ПА индуцирует, в первую очередь, снижение содержания его растворимых конъюга-тов, а затем и нерастворимых конъюгатов. Однако полученные данные свидетельствуют о влиянии экзогенных ПА на содержание внутриклеточного пролина в растениях шалфея в условиях окислительного стресса, но не позволяют сделать вывод о прямой регуляции ими содержания внутриклеточного пролина.
Ключевые слова: Salvia officinalis — экзогенные полиамины — путресцин — спермидин — спермин — пролин — окислительный стресс — СОД — паракват
ВВЕДЕНИЕ
Клетки высших растений продуцируют активные формы кислорода (АФК), в частности, супероксид-радикал и пероксид водорода, как вторичные сигнальные молекулы во многих метаболических процессах, связанных с ростом и
Сокращения: ОС — окислительный стресс, СОД — суперок-сиддисмутаза, ПА — полиамины, Пут — путресцин, Спд — спермидин, Спм — спермин, ДАП — диаминопропан, PQ — паракват.
Адрес для корреспонденции: Радюкина Наталия Львовна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Электронная почта: natrad@yandex.ru
развитием растений, а также с действием стрессоров [1]. Повышенное содержание АФК приводит к окислению липидов, белков, ДНК, углеводов и, как результат, к гибели организма. В связи с этим, любой организм должен иметь систему, поддерживающую определенный уровень АФК. В растениях функционируют различные метаболические пути, позволяющие синтезировать множество низкомолекулярных соединений с антиоксидант-ными свойствами, к которым относятся полиамины (ПА) и пролин. Стресс-индуцируемая аккумуляция этих низкомолекулярных соединений коррелирует с повышением устойчивости растений к действию абиотических стрессоров [2—6].
Внутриклеточное содержание этих низкомолекулярных веществ должно строго регулироваться, поскольку повышение содержания одного из низкомолекулярных соединений может служить сигналом для активации или замедления протекания других метаболических реакций [7]. Однако не только вопросы регуляции метаболизма низкомолекулярных соединений, но и взаимоотношения между ними, так же как и между высокомолекулярными и низкомолекулярными компонентами антиоксидантной системы, остаются мало изученными.
Ранее нами было проведено исследование влияния экзогенного пролина на содержание внутриклеточных ПА путресцинового ряда в листьях шалфея в нормальных условиях и при действии УФ-В облучения [8]. Было обнаружено, что индукция биосинтеза путресцина (Пут) наблюдалась в присутствии экзогенного пролина и начиналась раньше, чем при действии только УФ-В облучения. При совместном действии двух факторов уровень свободного Пут в листьях имел тенденцию к увеличению. О косвенной взаиморегуляции путей биосинтеза пролина и ПА свидетельствуют данные, полученные в работах разных авторов, использовавших обработку растений глутаматом [9], орнитином [10] и аргинином [11]. Во всех экспериментах используемые предшественники стимулировали накопление пролина. Опубликованные работы по влиянию экзогенных ПА на аккумуляцию пролина можно условно разделить на две группы. В первой группе публикаций сообщалось, что свободные ПА (спермидин (Спд) и спермин (Спм)) ингибировали осмоинду-цируемую аккумуляцию пролина у растений [9, 12]. Во второй группе публикаций, наоборот, было продемонстрировано, что при экзогенной обработке ПА увеличивалось содержание пролина в растениях как в контрольных, так и в стрессовых условиях [3—5, 7—14].
Обе группы представленных данных подтверждают существование конкуренции между путями биосинтеза пролина и ПА. Но, тем не менее, в литературе вопрос о взаимоотношениях пролина и ПА в нормальных и стрессовых условиях остается дискуссионным. Еще менее изученным этот аспект является при развитии окислительного стресса (ОС), хотя очевидно, что эти вещества играют важную антиоксидантную роль. В связи с вышесказанным, исследование взаимоотношений пролина и ПА, представляется весьма важным.
В настоящей работе была поставлена задача исследовать корреляцию между изменениями в содержании внутриклеточного пролина, свободных и конъюгированных форм Пут, Спд и Спм и активности супероксиддисмутазы (СОД) под влиянием параквата (РР), модулятора супероксидного стресса, обработки индивидуальными
ПА и совместного действия ПА и PQ на растения шалфея.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растения шалфея (Salvia officinalis L.) выращивали до возраста 6 нед. (4—5 настоящих листьев) в водной культуре на питательной среде Джонсона, модифицированной по Winter [14]. Растения культивировали в камере фитотрона при 12-часовом световом периоде с использованием ламп Philips (F36W/54); мощность освещения — 37.6 Вт/м2. Температура воздуха составляла 23 ± 1°C/16 ± 1°C (день/ночь), относительная влажность воздуха — 55/70% (день/ночь). Листья 6-недельных растений шалфея обрабатывали 1 мл раствора, содержавшего 0.1 мкМ PQ в 0.05% Твин-80, как было описано ранее [10]. Сразу после завершения обработки сосуды с растениями переносили в темноту на 12 ч, а затем на свет для стимуляции образования свободных радикалов. Первые 12 ч эксперимента соответствовали темновому периоду, следующие — световому. Образцы листьев и корней отбирали через 12, 15, 18 и 24 ч после начала эксперимента, фиксировали жидким азотом и хранили при —70°С до проведения анализов.
При совместном действии ПА и PQ использовали ту же схему, как и при обработке одним PQ, с теми же точками фиксации. В качестве контроля использовали обработку листьев ПА: 0.5 мМ растворами Пут, Спд и Спм в 0.05% Твин-80, затем фиксировали через такие же интервалы, как и в опытах с PQ. Кроме того, вторым контролем были растения, зафиксированные сразу после обработки и PQ + ПА до перенесения в темноту.
Измерение сырой и сухой массы листьев проводили стандартным весовым методом. Определение активности СОД проводили спектрофото-метрически по реакции с нитросиним тетразоли-ем [14]. Экстракцию и определение свободного пролина проводили по методу Bates с соавт., как описано в работе [14].
Свободные ПА и диаминопропан (ДАП) в растительной ткани определяли в виде их дансили-рованных производных методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), как это было описано нами ранее [14].
Концентрацию белка в полученных ферментных препаратах измеряли по методу Esen [15].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Обработка листьев шалфея индивидуальными ПА в нормальных условиях выращивания
Содержание свободных и конъюгированных форм ПА. В контрольных растениях при нормальных условиях выращивания преобладающим ПА был Пут. Также максимальным было содержание
С 2
зК
я 9
X л
С
16 14 12
о 10
8
6
^ 2
(а)
3
1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
23
(б)
(в)
св. | р. к. | нр. к Вариант опыта
Рис. 1. Содержание свободных и конъюгированных форм ПА в контроле и через 12 ч после обработки индивидуальными ПА.
а — внутриклеточный Пут; б — внутриклеточные Спд, в — Спм. 1 — контроль, 2 — обработка Пут, 3 — обработка Спд, 4 — обработка Спм. св. — свободная форма, р. к. — растворимый конъюгат, нр. к. — нерастворимый конъюгат.
4
0
его нерастворимых конъюгатов (рис. 1). В дальнейшем до конца эксперимента содержание всех ПА и их конъюгированных форм у растений шалфея в нормальных условиях (контроль) оставалось практически постоянным, поэтому приведены данные только для точки 12 ч. Через 12 ч после обработки листьев раствором Пут внутриклеточное содержание свободного Пут и его растворимых конъюгатов увеличивалось незначительно, а нерастворимых конъюгатов несколько сильнее (рис. 1). Повышение внутриклеточного содержания Пут вызывало увеличение содержания свободных Спд и Спм, а также нерастворимых конъюгатов Спд и Спм. При этом избыток Пут инги-бировал образование растворимых конъюгатов Спд и Спм (рис. 1). При использовании для обработки листьев шалфея раствора Спд содержание внутриклеточного свободного Пут оставалось на уровне контроля, но снижалось содержани
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.