^^^^^^^^^^^^ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ
СТАТЬИ
581.1:581:575
ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННЫХ СТЕРОИДНЫХ гликозидов НА КУЛЬТИВИРУЕМЫЕ КЛЕТКИ КАРТОФЕЛЯ ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ
© 2007 г. Л. А. Волкова, С. Н. Маевская, А. Б. Бургутин, А. М. Носов
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 27.09.2006 г.
Показано действие фуростаноловых гликозидов (ФГ) в низких дозах на культуру клеток картофеля (Solanum tuberosum L.) как фактора, приводящего к повышению активности пероксидаз (гваяколза-висимой и аскорбатпероксидазы) и снижению уровня перекисного окисления липидов (ПОЛ) ниже контрольного значения. В условиях окислительного стресса (ОС), вызванного паракватом, ФГ способствовали меньшей степени повреждаемости клеточной культуры, что сопровождалось высокой активностью пероксидаз и снижением уровня ПОЛ по сравнению с действием одного параквата. На активность ферментов супероксиддисмутазы и каталазы ФГ не влияли. Динамика изменения содержания хлорофилла (a + b) и каротиноидов зависела не только от действия ФГ и параквата, но и от состава клеточной популяции. Зеленоватая ткань содержала больше пигментов и проявляла большую устойчивость к действию гербицида, чем белесая ткань. Обсуждаются возможные причины повышения устойчивости культивируемых клеток при обработке ФГ в условиях ОС, а также сходство и различие в реакции клеток на действие индукторов.
Solanum tuberosum - культура клеток - окислительный стресс - паракват - фуростаноловые гли-козиды
ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 5, с. 722-729
УДК
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время наряду с созданием устойчивых сортов растений применяют и другие методы, основанные на индуцировании генетически обусловленной устойчивости растений. Накоплен значительный объем данных о стимулировании естественной устойчивости растительных клеток с помощью природных и синтетических элисито-ров [1, 2]. К природным веществам, обладающим физиологической активностью, можно отнести стероидные гликозиды, выделенные из культуры клеток Dioscorea deltoidea. Гликозиды спироста-нолового ряда обладают выраженной фунгицид-ной и антимикробной активностью, но при экзогенном воздействии на растение проявляют токсичность. Фуростаноловые гликозиды (ФГ), в отличие от спиростаноловых, менее токсичны;
Сокращения: АО защита - антиоксидантная защита; АФК -активные формы кислорода; АскП - аскорбатпероксидаза; ГП - гваяколзависимая пероксидаза; Кат - каталаза; ОС -окислительный стресс; ПОЛ - перекисное окисление липидов; СОД - супероксиддисмутаза; ТБК - тиобарбитуровая кислота; ТБК-АП - активные продукты, взаимодействующие с ТБК; ФГ - фуростаноловые гликозиды. Адрес для корреспонденции: Бургутин Александр Борисович. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Факс: 007 (495) 977-80-18; электронная почта: burgutin@yahoo.com
однако в определенных условиях они могут переходить в спиростаноловую форму под воздействием в-гликозидазы [3]. Обработка растений ФГ стимулирует их защитные реакции, которые способствуют в условиях стресса снижению уровня повреждения растительных клеток [4-6]. Показана способность ФГ активировать разные формы пероксидазы в течение длительного времени в условиях биотического стресса [6]. В одном из исследований [5] установлено влияние ФГ на скорость биосинтеза пигментов, в том числе и на уровень пигментов виолоксантинового цикла, как одной из биохимических систем защиты растительного организма от окислительного стресса (ОС). Вместе с тем следует заметить, что влияние ФГ на формирование адаптивных реакций при ОС мало изучено на клеточном уровне, особенно на начальном этапе ответной реакции.
Клеточные культуры являются удобной моделью для изучения защитного действия разных веществ в условиях стресса, так как популяция клеток in vitro - лабильная система, изменяющая свои характеристики в результате даже небольших воздействий. Лишенные контроля интегрирующих систем целого растения, культивируемые клетки проявляют именно клеточный уровень адаптивного ответа. Кроме того, проникновение агента в культивируемые клетки осуществляется достаточно быстро, что позволяет раньше реги-
стрировать активацию процесса иерекисного окисления липидов (ПОЛ), исполняющего роль пускового механизма в системе формирования ответных реакций [7].
В данной работе исследовали влияние ФГ на антиоксидантную (АО) реакцию у клеточной культуры картофеля в условиях ОС. Задачей данного исследования было изучение в динамике реакции клеток in vitro на действие ФГ и параквата -индуктора ОС [8], и их совместному воздействию. Анализировали уровень ПОЛ и активность ферментов АО защиты - супероксиддисмутазы (СОД), каталазы (Кат), гваяколовой пероксидазы (ГП) и аскорбатпероксидазы (АскП), жизнеспособность клеточной культуры, а также содержание хлорофиллов (a + b) и каротиноидов в течение 1 ч и через 24 ч.
МЕТОДИКА
Объектом исследования служила каллусная культура клеток картофеля Solanum tuberosum L. сорта Tawa (к4539, ВИР), поддерживаемая длительное время (более 5 лет) на питательной среде [9], содержавшей соли по прописи Murashige и Skoog [10]. Каллусную ткань выращивали на свету (освещенность 2-3 клк, лампы ЛБ40) при фотопериоде 16 ч и температуре 26°C. Изучаемая клеточная культура состояла из двух субпопуляций клеток, различающихся по содержанию пигментов. Клетки, расположенные в самой верхней части ткани, были, в основном, зеленоватые, а нижележащие слои имели белесый цвет. В зависимости от целей эксперимента для анализа брали либо пробу обеих зон (определяли уровень ПОЛ, активность ферментов и жизнеспособность смешанной ткани), либо анализировали каждую зону отдельно (определяли содержание пигментов и жизнеспособность клеток). Ткань анализировали в конце пассажа, который длился не более 28-30 суток.
Применение ФГ и параквата. Каллусную культуру обрабатывали паракватом, погружая в раствор 50 мкМ гербицида на 5 мин. Реакцию клеточной культуры на воздействие изучали в интервале от 5 мин до 24 ч. Обработку ФГ в разных концентрациях (от 0.045 до 450 мкМ) проводили аналогично. Фракция ФГ, выделенная из водного экстракта лиофильно высушенной клеточной культуры Dioscorea deltoidea Wall, штамм ИФР ДМ-0.5, представляла собой смесь фуростаноло-вых гликозидов: дельтозида и протодиосцина в соотношении 2 : 3 [6]. При исследовании совместного действия ФГ и параквата вначале проводили обработку ткани ФГ в течение 5 мин, а затем, после удаления раствора ФГ, паракватом в течение 5 мин. Контролем служила исходная каллусная культура, не подвергнутая обработке. Для биохимических исследований пробы фиксировали жид-
ким азотом в отмеченные моменты времени и до анализа хранили при температуре -70°С.
Определение степени перекисного окисления липидов. Степень окисления липидов оценивали спектрофотометрически по ТБК-тесту (с тиобар-битуровой кислотой) на основе реакции взаимодействия с ТБК конечных продуктов окисления, в том числе малонового диальдегида, с образованием окрашенного комплекса ТБК и взаимодействующих с ней активных продуктов (ТБК-АП) при высокой температуре в кислой среде [11]. Навеску каллусной ткани растирали в ступке в 0.1 N Н^04. Добавляли 0.67%-ный раствор ТБК в 50%-ной СН3СООН и помещали образцы в кипящую водяную баню на 30 мин. Пробы центрифугировали при 4000 g в течение 15 мин, и измеряли оптическую плотность супернатанта при 532 нм за вычетом неспецифического поглощения при 600 нм. Количество ТБК-АП рассчитывали с учетом коэффициента экстинкции £ = 1.56 х 105 (М см)-1 и выражали в мкмоль/г сырого веса. Каждый вариант включал 4 биологические повторности.
Определение активности ферментов. Суммарную активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли с использованием тетразолия нитро-синего, конкурирующего с СОД за супероксидные анионы, образующиеся в результате взаимодействия метионина и рибофлавина при освещении в течение 30 мин и температуре 25°С по методу [12]; оптическую плотность измеряли при 560 нм; активность фермента выражали в относительных единицах на 1 г сырой массы.
Активность гваяколзависимой формы пероксидазы определяли по изменению оптической плотности реакционной смеси при 470 нм по методу Ярош и др. [13]; активность фермента рассчитывали по количеству окисленного за 1 мин гваякола на 1 г сырой массы и выражали в условных единицах. Активность каталазы определяли по количеству разложившейся перекиси (в мкмоль/(мин г сырой массы)) с учетом £ = 39.4 (М см)-1 [14].
Для определения активности аскорбатпероксидазы (АскП) навеску (0.3-0.35 г) каллусной ткани растирали в охлажденной ступке в 1 мл среды, содержавшей 0.1 М Hepes-KOH-буфер (рН 7.0), 1 мМ ЭДТА и 2% (вес/объем) нерастворимого по-ливинилпирролидона, который вносили непосредственно при гомогенизации. Гомогенат центрифугировали в течение 15 мин при 15000 g при 4°С. Супернатант использовали для определения активности фермента. Активность АскП определяли по уменьшению оптической плотности при 298 нм в результате окисления аскорбиновой кислоты перекисью водорода (£ = 0.80 (мМ см)-1), согласно методу GerЫmg и др. [15]. Реакционная смесь (общий объем 3 мл) содержала 2 мл 100 мМ Hepes-KOH-буфера (рН 7.0), 0.5 мл 3 мМ аскорбиновой кислоты, 0.1 мл 3 мМ ЭДТА, 0.2 мл 1.5 мМ
Таблица 1. Влияние разных концентраций фуростаноловых гликозидов на активность гваяколовой пероксидазы и жизнеспособность клеточной культуры картофеля
Концентрация, мкМ Время обработки, ч Активность пероксидазы, % от контрольного уровня Жизнеспособность
% живых клеток % от контрольного уровня
450 1 265.0 ± 8.0 - -
3 250.0 ± 7.3 - -
22 89.8 ± 2.8 40.1 ± 1.2 55.7
45 1 230.8 ± 7.1 - -
3 175.0 ± 6.9 - -
22 82.6 ± 3.2 46.7 ± 1.9 64.9
4.5 1 235.0 ± 8.7 - -
3 202.8 ± 6.2 - -
22 115.0 ± 4.6 64.4 ± 2.4 89.4
0.45 1 215.0 ± 7.7 - -
3 129.1 ± 5.2 - -
22 97.0 ± 3.9 68.5 ± 2.1 95.1
0.045 1 178.3 ± 7.1 - -
3 126.5 ± 4.7 - -
22 91.8 ± 3.2 67.4 ± 2.3 93.6
Примечание. Контрольный уровень жизнеспособности, т.е. жизнеспособность исходной клеточной культуры (смешанная ткань) без воздействий, в данном эксперименте составлял 72.0
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.