ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2009, том 428, № 6, с. 845-848
ОБЩАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 591.39:591.31+577.17
ВЛИЯНИЕ р-ЭНДОРФИНА НА ДОИМПЛАНТАЦИОННОЕ РАЗВИТИЕ ЭМБРИОНОВ МЫШИ Ш VITRO
© 2009 г. А. С. Чернов, Ю. А. Ковалицкая, Н. Ю. Сахарова,
член-корреспондент РАН Л. М. Чайлахян
Поступило 25.06.2009 г.
Пептидные ростовые факторы играют важную роль на доимплантационных стадиях развития млекопитающих, так как влияют на скорость эмбрионального развития, метаболизм и долю эмбрионов, развивающихся до стадии бластоцисты, а также на количество клеток, составляющих бла-стоцисту [1].
Одним из факторов, который может оказывать влияние на развитие ранних эмбрионов in vivo, является опиоидный нейропептид — p-эндорфин. Он образуется из проопиомеланокортина (ПОМК), синтезируемого в гипофизе. Показано, что р-эн-дорфин, выделенный у разных видов (овца, верблюд и человек), обладает сходным действием [2—4]. p-эндорфин секретируется фолликулярными клетками, окружающими яйцеклетку, и по-видимому, регулирует созревание и овуляцию ооцитов [5], а клетки эндометрия секретируют p-эндорфин во время имплантации эмбриона в стенку матки [6].
Ранее нами было показано, что синтетические пептиды (SLTCLVKGFY и VKGFY), подобные центральной части молекулы p-эндорфина, стимулируют развитие эмбрионов мыши in vitro [7, 8]. Это позволяет предположить, что и сам p-эндорфин может участвовать в регуляции процессов раннего развития.
Целью данной работы было изучение влияния p-эндорфина на развитие доимплантационных эмбрионов мыши in vitro.
Опыты проводили на 2-, 4- и 8-клеточных эмбрионах, полученных от 8—10 недельных самок мышей стока SHK, которых забивали цервикаль-ной дислокацией. Полученных эмбрионов культивировали в модифицированной среде М16 ("Sigma", США) при 37°С в атмосфере 5%-ного СО2 в течение 2—3 дней до достижения эмбриона-
Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской Академии наук, Пущино Московской обл. Филиал института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии наук, Пущино Московской обл.
ми контрольной группы конечной стадии доим-плантационного развития — бластоцисты [9].
Наблюдения за состоянием эмбрионов проводили каждые 24 ч с помощью инвертированного микроскопа (Axiovert 200М, "Zeiss"). Стадию развития определяли по количеству бластомеров и по морфологии эмбриона. Состояние эмбрионов на стадии бластоцисты оценивали по форме, размерам и расположению клеток трофобласта и внутренней клеточной массы (ВКМ). В конце наблюдения определяли общее количество эмбрионов, сформировавших бластоцисту. По соотношению размеров ВКМ и полости различали ранние, средние и поздние бластоцисты, а также подсчитывали количество бластоцист, вышедших из блестящей оболочки, т.е. готовых к имплантации в стенку матки (рис. 1). К погибшим эмбрионам относили эмбрионы, остановившиеся в развитии в период дробления, и бластоцисты с аномальным строением. В работе использовали p-эндорфин человека ("Sigma", США) в концентрации 0.1 мкМ, которая находится в диапазоне физиологических концентраций (10—6—10-12 М ) и была подобрана ранее [7, 8]. Полученные данные обрабатывали с помощью i-критерия Стьюдента [10].
Результаты показали, что при культивировании 2-клеточных эмбрионов через 24 ч большинство эмбрионов достигло 8-клеточной стадии и в контроле, и в опыте (табл. 1). Через 48 ч было обнаружено, что в присутствии р-эндорфина 31.4% эмбрионов перешли уже на стадию ранней бла-стоцисты, а в контроле эмбрионы находились на стадии 8 бластомеров или многоклеточной мору-лы, и лишь 2.6% — на стадии ранней бластоцисты. Через 72 ч общее количество эмбрионов, достигших стадии бластоцисты, в опыте и в контроле было одинаковым, однако количество поздних бластоцист в присутствии p-эндорфина достоверно больше, а количество эмбрионов, остановившихся в развитии, было меньше, чем в контроле (табл. 1). Эти данные показывают, что р-эндорфин положительно влияет на развитие 2-клеточных эмбрионов мыши, и в его присутствии ускоряются
846
ЧЕРНОВ и др.
Рис. 1. Зародыши мыши на различных стадиях развития: бластоциста ранняя (а), средняя (б), поздняя (в), выход бла-стоцисты из блестящей оболочки (г).
процессы, ведущие к образованию бластоцисты (табл. 1).
Исследование действия р-эндорфина на развитие 4-клеточных эмбрионов мыши не обнаружило через 24 ч культивирования различий между состоянием эмбрионов в опыте и в контроле: количество эмбрионов, достигших 8-клеточной стадии, достоверно не различалось (табл. 1). Однако через 48 ч в присутствии в среде р-эндорфина доля эмбрионов, достигших стадии морулы, была достоверно выше, чем в контрольной группе. В опытной группе обнаружено также небольшое количество ранних бластоцист, а в контрольной группе бластоцисты отсутствовали (табл. 1). Через 72 ч общее количество эмбрионов, достигших стадии бластоцисты, в обеих группах достоверно не различалось, но в присутствии р-эндорфина количество поздних бластоцист было больше, чем в контроле (32.1 и 11.1% соответственно), а погибших эмбрионов меньше (табл. 1). Эти данные показывают, что р-эндорфин не влиял на процессы дробления 4-клеточных эмбрионов, но способствовал увеличению количества морул, а также ускорял формирование бластоцист.
Изучение действия ß-эндорфина на развитие 8-клеточных эмбрионов мыши показало, что через 24 ч в присутствии ß-эндорфина 12.9% эмбрионов перешло уже на стадию ранней бластоци-сты, в то время как в контроле все эмбрионы находились на стадии морулы (табл. 1). Через 48 ч большинство эмбрионов и в опыте, и в контроле достигли стадии бластоцисты, однако в опыте количество поздних и вышедших из оболочки бла-стоцист было больше, а погибших достоверно меньше (табл. 1).
Известно, что короткие пептиды, в том числе и ß-эндорфинподобные, при добавлении в среду культивирования подвергаются протеолизу и распадаются на составляющие аминокислоты в течение первых 5—10 мин [11]. Ранее нами было показано, что коктейль аминокислот (Val, Lys, Gly, Phe и Tyr), составляющих ß-эндорфинподобный пептид пентарфин, не оказывал аналогичного пептиду стимулирующего действия на раннее развитие эмбрионов мыши [8]. Можно предположить, что, ß-эндорфин, как и ß-эндорфинподобные пептиды, оказывает свое кратковременное воздействие на эмбрионы в момент введения вещества в среду.
ВЛИЯНИЕ в-ЭНДОРФИНА
Таблица 1. Влияние в-эндорфина на развитие ранних эмбрионов мыши in vitro
847
Число 24 ч 48 ч 72 ч
Вариант эмбрионов эмбриональная стадия % эмбриональная стадия % эмбриональная стадия %
2-клеточные эмбрионы
Контроль 38 2-кл. - 4-кл. 7.9 Погибшие 26.3
4-кл. 13.2 8-кл. 44.7 Всего бластоцист 73.7
8-кл. 86.8 Морулы 44.8 Ранние 5.3
Ранние бластоцисты 2.6 Средние 36.8
Поздние 18.4
Выклюнувшиеся 13.2
в-эндорфин 35 2-кл. 8.6 2-кл. 8.6 Погибшие 20
4-кл. - 8-кл. 14.3* Всего бластоцист 80
8-кл. 91.5 Морулы 45.7 Ранние -
Ранние бластоцисты 31.4* Средние 22.9
Поздние 42.9*
Выклюнувшиеся 14.2
4-клеточные эмбрионы
Контроль 27 4-кл. 11.1 4-кл. 18.5 Погибшие 29.6
8-кл. 88.9 8-кл. 14.8 Всего бластоцист 70.4
Морула 66.7 Ранние 3.8
Ранние бластоцисты - Средние 40.7
Поздние 11.1
Выклюнувшиеся 14.8
в-эндорфин 28 4-кл. 3.6 4-кл. 3.6 Погибшие 21.4
8-кл. 96.4 8-кл. 10.7 Всего бластоцист 78.6
Морула 82.1** Ранние 3.6
Ранние бластоцисты 3.6 Средние 28.6**
Поздние 32.1**
Выклюнувшиеся 14.3
8-клеточные эмбрионы
Контроль 29 8-кл. 27.6 Погибшие 27.5***
Морула 72.4 Всего бластоцист 72.4
Бластоциста - Ранние -
Средние 34.5
Поздние 13.8
Выклюнувшиеся 24.1
в-эндорфин 31 8-кл. 12.9 Погибшие 16.1
Морула 74.2 Всего бластоцист 83.9
Бластоциста 12.9* Ранние -
Средние 16.1
Поздние 29*
Выклюнувшиеся 38.7*
* Достоверное различие по отношению к контролю, р < 0.05. ** Достоверное различие по отношению к контролю, р < 0.1. *** Достоверное различие по отношению к контролю,р < 0.5.
848
ЧЕРНОВ и др.
Таким образом, наши данные позволяют сделать вывод, что независимо от того, на какой стадии находились эмбрионы, их реакция на р-эн-дорфин была сходной: в его присутствии эмбрионы быстрее достигали стадии бластоцисты и успешнее проходили все фазы ее формирования. Положительное влияние р-эндорфина подтверждается и тем, что во всех подопытных группах снижалась гибель эмбрионов на всех стадиях до-имплантационного развития. По-видимому, р-эн-дорфин влияет на подготовительные процессы, которые на ранних стадиях дробления определяют последующее формирование бластоцист. Последнее представление основано на данных, показывающих значимость каждой стадии раннего дробления для формирования бластоцист [12]. Возможно, р-эндорфин, взаимодействуя с рецептором, запускает на ранних стадиях доимпланта-ционного развития некий каскад реакций, который влияет на процессы транскрипции продуктов, необходимых для формирования как морулы, так и бластоцисты. В этом отношении стимулирующее действие р-эндорфина схоже с действием ин-сулиноподобного фактора роста, который при добавлении в среду культивирования в период дробления проявляет свой эффект во время формирования бластоцисты [13].
Ранее было высказано предположение, основанное на способности р-эндорфина активировать развитие и регенерацию нервной ткани, что он может выступать как неспецифический ростовой фактор [14]. Выявленная нами способность р-эндорфина стимулировать процессы первичной дифференцировки у ранних эмбрионов мыши, образование зрелых бластоцист и выход их из оболочки оплодотворения позволяет считать, что
в регуляции доимплантационного развития р-эн-дорфин также играет роль фактора роста.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Hardy K, Spanos S. //J. Endocrinol. 2002. V 172. P. 221-261.
2. Li C.H., Barnafi L, Chretien M. et al. // Nature. 1965. V. 208. P. 1093-1094.
3. Li C.H, Chang D. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1976. V. 73. P. 1145-1148.
4. Li C.H., Chang D, Doneen B.A. // Biochem. and. Bio-phys. Res. Communs. 1976. V. 72. P. 1542-1547.
5. Lim A.T., Lolait S, Barlow J.W. et al. // Nat
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.