БИОХИМИЯ, 2010, том 75, вып. 9, с. 1290 - 1298
УДК 612.115.12
ВЛИЯНИЕ ЭНТЕРОПЕПТИДАЗЫ НА ВЫЖИВАЕМОСТЬ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ГИППОКАМПАЛЬНЫХ НЕЙРОНОВ В УСЛОВИЯХ ГЛУТАМАТНОЙ ТОКСИЧНОСТИ
© 2010 г. А.М. Макарова1, Л.Р. Горбачева1, И.В. Савинкова1, А.Г. Михайлова3, Л.Д. Румш3, В.Г. Пинелис 2, С.М. Струкова1*
1 Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова,
119991 Москва; электронная почта: strukova@mail.ru
2 Научный центр здоровья детей РАМН, 119991 Москва,
Ломоносовский просп., 2/62
3 Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10
Поступила в редакцию 24.12.09 После доработки 27.04.10
Исследовано влияние полноразмерной энтеропептидазы быка (ВЕК) и рекомбинантной легкой цепи энте-ропептидазы человека (Ь-НЕР) на выживаемость культивируемых гиппокампальных нейронов при эксай-тотоксичности, вызванной глутаматом. Показано, что низкие концентрации Ь-НЕР (0,1—1 нМ) и ВЕК (0,1—0,5 нМ) защищают нейроны гиппокампа от гибели, вызванной 100 мкМ глутаматом. С помощью антагониста рецептора тромбина (РАЯ1)-8СН79797 выявлен РАШ-зависимый механизм нейропротекторно-го действия низких концентраций энтеропептидазы. Защитное действие полноразмерной энтеропептидазы при глутаматной цитотоксичности не проявлялось в концентрациях 1 и 10 нМ, и, более того, 10 нМ ВЕК вызывает гибель 88,9% нейронов, что существенно превышает гибель клеток от глутамата (31,9%). Даже при концентрации Ь-НЕР 10 нМ выживаемость нейронов была выше на 26,8%, чем при действии 10 нМ ВЕК в условиях глутаматной токсичности. Предобработка клеток 10 нМ энтеропептидазой обеих форм отменяла протекторный эффект 10 нМ тромбина при глутаматной цитотоксичности. Высокие концентрации ВЕК и Ь-НЕР вызывают гибель нейронов преимущественно путем некроза.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: энтеропептидаза, глутаматная токсичность, апоптоз, гиппокампальные нейроны, рецепторы, активируемые протеиназами.
Энтеропептидаза (энтерокиназа) (КФ 3.4.21.9) (высокоспецифичная протеиназа процессинга) синтезируется энтероцитами двенадцатиперстной кишки (дуоденума) и локализуется в слизистой дуоденума и тонкой кишки [1]. Активируя трипсиноген в процессе пищеварения, энтеропептидаза с высокой эффективностью катализирует гидролиз полипептидной цепи, отщепляя N-концевой активационный пептид после последовательности —Asp—Asp—Asp—Asp—Lys-
Принятые сокращения: BEK — полноразмерная энтеропептидаза быка; L-HEP — рекомбинантная легкая цепь энтеропептидазы человека; PAR — рецептор, активируемый протеиназой; АРС — активированный протеин С; ФХа — Х-активный фактор свертывания крови; DMSO — диметилсульфоксид; МТТ — бромид 3-[4,5-диметилтиазо-лил-2]-2,5-дифенилтетразолия. * Адресат для корреспонденции.
[2, 3]. Такая высококонсервативная последовательность содержится в структуре трипсиноге-нов всех позвоночных [4]. Образовавшийся трипсин, в свою очередь, активирует целый ряд других зимогенов, таких как химотрипсиноген, проэластаза, прокарбоксипептидаза, пролипаза и профосфолипаза [1]. Обнаружена экспрессия мРНК энтеропептидазы в желудке, толстой кишке и мозге [5], в котором найдены трипси-ноподобные протеиназы [6]. При патологии (например, при остром панкреатите) энтеро-пептидазу обнаруживают в кровотоке [7, 8]. Клетки рака желудка экспрессируют трипсин и энтеропептидазу [9].
Недавно было показано, что кератиноциты человека синтезируют энтеропептидазу и множественные формы трипсиногенов [10], в том числе трипсиноген IV, который первоначально был идентифицирован в мозге человека [6]. К
настоящему времени накоплены доказательства того, что трипсин и трипсиноподобные серино-вые протеиназы играют важную роль не только в пищеварении, но и в развитии нейронов, пластичности мозга и в нейродегенерации и нейро-регенерации мозга [11, 12]. В связи с этим исследование влияния энтеропептидазы на процессы нейродегенерации мозга представляется весьма актуальным.
Аминокислотные последовательности энте-ропептидаз млекопитающих [5, 13—17] высокогомологичны — степень идентичности достигает 82—85%. Молекула энтеропептидазы состоит из двух полипептидных цепей — тяжелой (120—140 кДа) и легкой (35—62 кДа), соединенных ди-сульфидной связью. Легкая цепь энтеропепти-дазы имеет консервативную для сериновых про-теиназ последовательность: она содержит N-концевой Ile16 (IVGG), типичную каталитическую триаду Asp102—His57—Ser195, оксианион-ную впадину, сформированную атомами основной цепи остатков 193 и 195, а также типичный для ферментов с первичной трипсиновой специфичностью «карман связывания», на дне которого находится остаток Asp189 ^1-центр связывания субстрата) [18]. Помимо S1-центра основной детерминантой распознавания энтеро-пептидазой DDDDK-последовательности субстрата является остаток Lys99 — часть последовательности из четырех положительно заряженных остатков энтеропептидазы (96—99) [18]. При этом энтеропептидаза быка содержит последовательность —Lys—Arg—Arg—Lys—, а энтеро-пептидаза свиньи и человека — —Arg—Arg— Arg—Lys— [17]. Считается, что в искусственных субстратах энтеропептидазы аминокислотные остатки аспарагиновой кислоты эквивалентны остаткам глутаминовой кислоты, а остаток лизина — остатку аргинина [18, 19].
Рекомбинантные легкие цепи энтеропептидазы быка (L-BEK) [19] и человека (L-HEP) [20]
сохраняют высокую специфичность природного фермента по отношению к гидролизу полипептидной цепи субстрата после последовательности DDDDK. При этом эффективность гидролиза и некоторые его закономерности заметно различаются как при сравнении полноразмерного природного и укороченного рекомбинантного фермента, так и в случае L-HEP и L-BEK [21].
До последнего времени считалось, что последовательность —Asp—Asp—Asp—Lys— консервативна и в природных белках встречается только в составе .N-концевых активационных пептидов различных трипсиногенов [4]. Однако недавно было обнаружено, что активируемые тромбином рецепторы (PAR1) содержат последовательности, аналогичные активационному пептиду трипсиногена: —Glu—Asp—Glu—Glu—Lys— (PARI человека и обезьян), -Asp-Glu-Glu-Glu-Glu-Lys- (PARI мыши), -Asp-Glu-Glu-Glu-Lys- (PARI хомяка и крысы). Исходя из этого, а также из данных о роли трипсиноподобных се-риновых протеиназ (тромбина, активированного протеина С и трипсина IV) в процессах дегенерации нейронов мозга [6, 22-25] интересно исследовать влияние энтеропептидазы на мембранный рецептор тромбина - PAR1 (рецептор 1, активируемый протеиназой), потенциальный второй природный субстрат высокоспецифического фермента энтеропептидазы. Тромбин, взаимодействуя с PAR1, обеспечивает эффективный протеолиз одной пептидной связи (Arg41-Ser42) во внеклеточном домене PAR, открывая новый ^-конец рецептора, так называемый привязанный лиганд (SFLLRN), который служит агонистом этого рецептора [26, 27] (схема). Ряд протеиназ расщепляет PAR по сайтам, отличным от сайтов активации, с образованием рецепторов, не способных к последующей протеолитической активации. Так, катепсин G и трипсин могут не только расщеплять PAR1 по сайту Arg41-Ser42, но и неспецифически рас-
Протеолиз N-концевого пептида PAR1 человека
тромбин ^^
I катепсин G катепсинС катепсин G HLE HLE
▼ i I in
R27RPESKATNATLDPR41 SF LLRNPNDKYEPFWE57DEEK61NESGLTEY RLV SI NKS-
t t t
APC,катепсин G, трипсин энтеропептидаза? трипсин
Схема протеолиза ^-концевого пептида PAR1 человека, ведущего к активации рецептора (тромбин, активированный протеин С (АРС), трипсин, катепсин G) и к инактивации рецептора (трипсин, катепсин G, протеиназа 3 (PR3), эластаза (HLE) и гипотетически энтеропептидаза)
щеплять другие связи в структуре рецептора [28, 29]. При этом происходит удаление привязанного лиганда, что делает рецептор нечувствительным к тромбину. При гидролизе PAR1 энтеро-пептидазой по сайту Lys61—Asn62 также может инактивироваться рецептор, что приводит к терминации сигнала (схема) [30]. Такая инактивация может работать как механизм регуляции, посредством которой внеклеточные протеиназы и протеиназы, связанные с клеточной поверхностью, терминируют активацию PAR [31] и служат их инактиваторами.
PAR1 широко распространен в желудочно-кишечном тракте, и в частности найден на апикальных мембранах энтероцитов [32]. Экспрессия мРНК протромбина, а также PARs обнаружена в областях мозга (кора, стриатум, гипоталамус, гиппокамп, мозжечок и др.), наиболее уязвимых для ишемического повреждения [11]. Однако функциональное значение энтеропеп-тидазы в мозге остается неизвестным.
В наших экспериментах было исследовано действие полноразмерной энтеропептидазы быка (BEK) и легкой цепи рекомбинантной энтеропептидазы человека (L-HEP) на выживаемость культивируемых гиппокампальных нейронов при глутаматной цитотоксичности, моделирующей нейродеструктивные процессы в мозге.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы. В работе были использованы: тромбин быка, ARAC, поли^-лизин, гелдана-мицин, MTT (3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) и BPTI («Sigma», США), нейробазальная среда А, содержавшая 2%-ный Supplement B-27 и L-глутамин («Gibco», США); SCH 79797 - антагонист PAR1 (TOCRIS, Великобритания).
Получение энтеропептидазы. Энтеропептида-зу выделяли из слизистой дуоденума быка и очищали разработанным ранее методом [33]. Активность препаратов фермента определяли по скорости активации трипсиногена и гидролиза (Z-Lys-S-Bzl) [34].
L-HEP [20] была любезно предоставлена M.E. Гаспарян (ИБХ РАН).
Получение культуры гиппокампальных нейронов. Исследования проводили на первичных культурах нейронов гиппокампа (9-10 дней), полученных из мозга 1—3-дневных крысят линии Вистар. Суспензию клеток (106 кл/мл) получали ранее описанным методом [35] и переносили на покровные стекла (в объеме 200 мкл на 1 стекло), покрытые поли^-лизином (10 мг/мл).
Через 1 ч (37°, 5% СО2) удаляли неприкрепив-шиеся клетки и добавляли 1,5 мл культуральной среды (нейробазальная среда А, содержавшая 2% Supplement B-27 и 0,5 мМ L-глутамина). На третий день добавляли арабинозид (ARAC, 10-5 М) для подавления роста глиальных клеток.
Оценка гибели нейронов. Гибель нейронов в культуре определяли через
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.