ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2008, том 55, № 2, с. 210-218
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ВЛИЯНИЕ ЭПИБРАССИНОЛИДА НА ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ ПО ТИРОЗИНУ НЕКОТОРЫХ ФЕРМЕНТОВ ЦИКЛА КАЛЬВИНА
© 2008 г. Е. О. Федина*, Ф. Г. Каримова*, И. А. Тарчевский*, И. Ю. Торопыгин**, В. А. Хрипач***
*Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук, Казань **Институт биомедицинской химии им. ВН. Ореховича Российской академии медицинских наук, Москва ***Институт биологической химии Национальной академии наук Белоруссии, Минск
Поступила в редакцию 23.03.2007 г.
Анализ белков грубого экстракта листьев гороха (Pisum sativum L.) с помощью двумерного электрофореза с последующим вестерн-блот-анализом с моноклональными антителами к фосфотирозино-вым белкам PY20 позволил выявить 44 фосфорилированных по тирозину полипептида; у некоторых из них уровень фосфорилированности изменялся под влиянием эпибрассинолида. Идентификация части этих полипептидов с помощью MALDI-TOF MS анализа показала, что 8 из них относятся к ферментам цикла Кальвина - изоформам большой и малой субъединиц РБФК/О, фруктозо-1,6-бис-фосфатальдолазам 1 и 2, а еще один - к предшественнику а-субъединицы РБФК/О-связываю-щего белка. Изменения фосфорилирования этих белков могут в известной степени объяснить ранее установленный феномен влияния брассиностероидов на фотосинтез растений. In silico определены сайты фосфорилирования по тирозину во фрагментах изученных выше полипептидов.
Ключевые слова: Pisum sativum - фосфорилирование белков по тирозину - эпибрассинолид -РБФК/О - РБФК/О-связывающий белок - MALDI-TOF MS анализ.
ВВЕДЕНИЕ
Эффективным и широко распространенным способом изменения активности ферментов и других белков является их фосфорилирование. Фосфорилирование белков осуществляется, главным образом, по остаткам серина, треонина, гистидина и тирозина [1]. Тирозиновое фосфорилирование у растений менее изучено, чем сериновое и треони-новое, но становится все более доказанной его важная роль в регуляции целого ряда процессов метаболизма у растений. Исследования последнего времени показали, что у растений вклад тирози-нового фосфорилирования в регуляцию клеточного метаболизма достаточно велик [2].
Изучению особенностей фосфорилирования-дефосфорилирования ферментов фотосинтетического усвоения углекислого газа было посвящено относительно мало работ. Было установлено, что
Сокращения: БСА - бычий сывороточный альбумин; ДТТ -дитиотрейтол; ИЭФ-буфер - буфер для изоэлектрофокуси-рования; ПВДФ мембраны - поливинилдифторные мембраны; ТБСТ - Трис-буфер солевой с Твином-20; ТЕМЕД - тет-раметилэтилендиамин; ТФУ - трифторуксусная кислота; ФМСФ - фенилметилсульфонилфторид; 2Э-электрофорез -двумерный электрофорез; CHAPS - 3-[(3-холамидопро-пил)-диметиламмоний]-1-пропансульфонат. Адрес для корреспонденции: Федина Евгения Олеговна. 420111 Казань, а/я 30. Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН. Факс: +7 (843) 297-73-47; электронная почта: fedina@mail.knc.ru
некоторые ферменты цикла Кальвина способны фосфорилироваться по серину и треонину [3]. В единственной работе было показано, что малые субъединицы РБФК/О фосфорилируются по сери-новым и тирозиновым остаткам; их дефосфорили-рование приводило к диссоциации малых и больших субъединиц и к падению активности РБФК/О [4].
Одним из факторов регуляции активности РБФК/О и других ферментов цикла Кальвина может быть изменение уровня их фосфорилирования под влиянием фитогормонов. 24-эпибрассинолид (ЭПБ) - один из наиболее активных представителей брассиностероидов, являющихся продуктами метаболизма клеток растений, структурно сходных со стероидными гормонами животных, вызывает широкий спектр клеточных ответов, включая рост растений, прорастание семян, фиксацию азота, повышение устойчивости к холоду, патогенам, солевому стрессу [5, 6]. Показано, что мутанты по ЭПБ характеризуются карликовостью, уменьшением биомассы и плодоношения [7]. Бoльшая часть современных исследований направлена на выяснение молекулярных механизмов передачи сигнала ЭПБ: выявлены рецепторы на плазматических мембранах, их трансфосфорилирование по Сер/Тре [8]; высказывается мнение об участии в брассиностероидном сигналинге других путей [9]. Обнаружена киназа, фосфорилирующая ядерные белки [10], а также новый класс транскрипцион-
ных факторов, участвующих в брассиностероид-регулируемой экспрессии генов [11].
Изучению влияния брассиностероидов на фотосинтез растений посвящено относительно мало исследований. Известно, что под действием этого гормона усиливается интенсивность фотосинтеза и повышается активность РБФК/О [12, 13], увеличивается содержание крахмала и растворимых сахаров, изменяется первичный углеродный метаболизм [14, 15].
В литературе отсутствуют сведения о влиянии брассиностероидов на тирозиновое фосфорилиро-вание белков, в том числе белков, обслуживающих цикл регенерации акцептора фотосинтетической фиксации СО2. Мы поставили перед собой задачу идентифицировать белки листьев гороха, тирозиновое фосфорилирование которых изменялось под действием ЭПБ, имея в виду, что к таким белкам могут относиться ферменты цикла Кальвина.
МЕТОДИКА
Растительный материал. Растения гороха (Pisum sativum L.) выращивали в условиях 10-часового фотопериода на питательной среде Хогланда-Арнона I при интенсивности освещения 10 клк в течение 9 дней. После отделения от корней побеги помещали на 20 мин в среду роста (контроль) или в среду с добавлением 0.1 мкМ ЭПБ.
Приготовление образца для двумерного электрофореза. Листья фиксировали в жидком азоте и гомогенизировали в среде (1 : 2), содержавшей 50 мМ Трис-буфер, рН 7.5, 1 мМ дитиотрейтол (ДТТ), 1 мМ фенилметилсульфонил фторид (ФМСФ), 10 мМ ЭДТА, 0.1 мМ ортованадат, 1 мМ теофиллин и 3%-ный поливинилпирролидон. Го-могенат центрифугировали в течение 10 мин при 5°С и 16000 g. Белки супернатанта для двумерного (2D) электрофореза осаждали холодным 80%-ным ацетоном. Осажденный белок промывали 3 раза холодным ацетоном и 100 мкг белка растворяли в 150 мкл буфера для изоэлектрофоку-сирования (ИЭФ-буфер: 8 М мочевина, 2 М тиомо-чевина, 2%-ный 3-[(3-холамидопропил)-диметил-аммоний]-1-пропансульфонат (CHAPS), 0.2%-ный амфолит, (pH 3-10), 3 мМ ДТТ и 20 мМ Трис-буфер).
Двумерный электрофорез. Полоски геля (стри-пы длиной 7 см) регидратировали с образцами при 20°C 12 ч в ИЭФ-буфере с иммобилизованным градиентом pH (рН 3-10). 2D-электрофорез проводили в камерах для ИЭФ при 20°C в следующем режиме: 15 мин при напряжении 250 В, затем напряжение линейно повышали до 4000 В в течение 2 ч, далее проводили ИЭФ образца при том же напряжении в течение 2 ч. Общее количество вольт-часов составило 24000, при 20°C, с силой тока 50 мкА на стрип. Затем стрипы выдерживали
15 мин в уравновешивающем буфере 1 (6 M мочевина, 2%-ный ДДС, 30%-ный глицерин, 50 мМ Трис-буфер, следы бромфенолового синего и 2%-ный ДТТ) и 15 мин в уравновешивающем буфере 2 (6 M мочевина, 2%-ный ДДС, 30%-ный глицерин, 50 мМ Трис-буфер, 0.005%-ный бромфено-ловый синий и 2.5%-ный йодацетамид). Стрип накладывали на мини-гель (Трис-глицин, толщина 1 мм, 6-20%-ный ПААГ). 2D-электрофорез проводили с использованием электродного буфера, содержавшего 25 мМ Трис-буфер, 192 мМ глицин и 0.1%-ный ДДС, при силе тока 5 мА на 1 гель в течение 20 мин, затем при 10 мА в течение 120-150 мин.
Иммуноблоттинг. Для изучения фосфорилиро-вания по тирозину после проведения 2D-электро-фореза белки переносили на поливинилдифтор-ные (ПВДФ) мембраны в течение 90 мин при постоянной величине электрического тока 150 мА, согласно стандартному протоколу, используя прибор для полусухого блоттинга. Затем мембраны в течение 1 ч блокировали 1%-ным бычьим сывороточным альбумином (БСА), растворенным в солевом Трис-буфере (ТБСТ: 10 мМ Трис-буфер, рН 7.5, 100 мМ NaCl и 0.05% Твин-20) при 5°С. Затем блоты инкубировали 1 ч при комнатной температуре с антителами к фосфотирозиновым белкам PY20, конъюгированными с пероксидазой хрена в разведении 1 : 1000 в ТБСТ. Высокая специфичность использованных нами моноклональ-ных антител PY20 подтверждена в наших предыдущих экспериментах [16].
Для визуализации тирозинового фосфорилиро-вания белков блоты инкубировали 1 мин в ECL-ре-агенте и экспонировали на рентгеновской пленке. Для визуализации полипептидов мембраны окрашивали 0.1%-ным Кумасси R-250 10 мин, затем отмывали 50%-ным этанолом.
Сопоставление фосфорилирования индивидуальных белков. Для вычисления удельного тирозинового фосфорилирования белков, разделенных электрофоретически, мембраны, окрашенные Кумасси R-250, и радиоавтографические пленки с фосфорилированными белками сканировали при помощи Epson Perfection 3170 Photo, и данные переводили в числовые значения оптической плотности при помощи программы Flicker (http://open2dprot.sourceforge.net/Flicker) (США). Удельное тирозиновое фосфорилирование выражали в относительных единицах (отн. ед.) как отношение оптической плотности фосфорилирован-ного белка (хемилюминесценции), идентифицированного на радиоавтографической пленке, к оптической плотности белка, идентифицированного на мембране, окрашенной Кумасси R-250.
Количественное определение белка. Количество белка измеряли, согласно методу Bradford [17], используя БСА в качестве стандарта.
Таблица 1. Характеристика растворимых белков Pisum sativum, фосфорилированных по тирозину и идентифицированных с помощью MALDI-TOF MS
№ пятнаа Экспериментальные величины мол. м., кД, и pI6 Рассчитанные величины мол. м., кД, и pIB №д Достоверность поискае Название белкаж
1 16/6.9 15.9/7.21 11 169148 105 предшественник малой субъединицы
РБФК/О
2 16/7.6 15.9/7.86 10 12019640 113 предшественник малой субъединицы
РБФК/О
18 31/7.2 53.2/5.83 15 532217 133 большая субъединица РБФК/О
19 31/7.6 49.5/6.13 10 14599580 94 большая субъединица РБФК/О
24 36/6.3 38.6/5.83 9 399024 119 хлоропластный предшественник
фруктозо-1,6-бис-фосфатальдолазы
25 36/6.5 37.8/5.48 11 461501 105 хлоропластная фруктозо-1,6-бис-
фосфатальдолаза
39 51/7.1 51.7/6.09 18 14599580 192 большая субъединица РБФК/О
4
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.