ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 2, с. 300-305
УДК 581.1:58.085.23:577.121:577.152.431
ВЛИЯНИЕ ФЕНИЛАЛАНИИА НА БИОСИНТЕЗ ПРОТОБЕРБЕРИНОВЫХ АЛКАЛОИДОВ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК
ВАСИЛИСТНИКА МАЛОГО
© 2007 г. Т. Б. Карягина, О. А. Гаевская, Е. А. Гукасова, Т. В. Тимченко, Д. И. Баирамашвили
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, Москва Поступила в редакцию 05.06.2006 г.
Введение 7 мМ фенилаланина (Фен) в среду культивирования василистника малого (Thalictrum minus L.) на 7-8-е сутки повышало выход в среду берберина в 2 раза. Одновременно с алкалоидами в клетках и в среде увеличивалось и содержание фенолов. Изучение активности фенилаланинамми-ак-лиазы (ФАЛ) и тирозинаммиак-лиазы (ТАЛ) показало, что экзогенный Фен усиливал активность ФАЛ на 35% и снижал активность ТАЛ на 20%. При разделении грубого экстракта на DEAE-Sephаcel было выделено два белка, один из которых обладал активностями ФАЛ и ТАЛ, другой проявлял только активность ФАЛ. Эта активность пропадала при культивировании клеток более 20 суток, а также при воздействии Фен в концентрации, снижающей биосинтез алкалоидов. Введение Фен приводило также к увеличению содержания белка как в клетках, так и в культуральной среде. При этом в культуральной среде возрастала доля низкомолекулярных белков. Тестирование антимикробных свойств среды показало, что они определяются берберином и, в меньшей степени, паль-матином. Белковая фракция также обладала антимикробными свойствами. Усиление антимикробной активности после введения Фен является следствием увеличения содержания алкалоидов и белков. Сделан вывод, что одним из механизмов действия Фен является регуляция биосинтеза алкалоидов через ферментную систему в самом начале фенилпропаноидного пути, который, в свою очередь, является одним из этапов в стресс-индуцированном ответе растений на воздействие патогенов.
Thalictrum minus - культура клеток - алкалоиды - берберин - фенилаланин - фенилаланинаммиак-лиаза - тирозинаммиак-лиаза
ВВЕДЕНИЕ
Накопление берберина в интактных растениях усиливается в ответ на инфицирование патогенами. Это свойство давно нашло широкое применение в медицине. В настоящее время препараты на основе берберина используют при лечении заболеваний желудка и желчного пузыря.
В клеточных культурах биосинтез берберина поддается регулированию с помощью абиогенных и биогенных факторов [1-3], что позволяет не только повышать продуктивность культуры, но также использовать ее как модель для изучения регуляции биосинтеза алкалоидов. В метаболизме
Сокращения: МИК - минимальная ингибирующая концентрация, Фен - фенилаланин, ФАЛ - фенилаланинаммиак-лиаза, ТАЛ - тирозинаммиак-лиаза.
Адрес для корреспонденции: Карягина Татьяна Борисовна. 117871 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10. Институт биоорганической химии РАН. Факс: 007 (095) 330-74-10; электронная почта: tankar@kou.ibch.ru
алкалоидов большое значение имеют аминокислоты. Показано, что их действие на накопление алкалоидов обладает полифункциональной специфичностью [2]. Влияние экзогенных аминокислот может осуществляться за счет увеличения их эндогенного уровня, через регуляцию активности ферментов вторичного биосинтеза, либо через регуляцию синтеза самих ферментов.
Введение фенилаланина (Фен) в среду культивирования василистника позволяет увеличить накопление алкалоидов в 2-3 раза [4]. Настоящая работа посвящена изучению влияния Фен на активность фенилаланинаммиак-лиазы (ФАЛ), ключевого фермента фенилпропаноидного метаболизма, активность которого может являться маркером при стрессовых воздействиях.
МЕТОДИКА
Культура клеток василистника малого (Thalictrum minus L.) была получена в НПО ВИЛАР в 1988 г. из черешка листа растения киргизской по-
соон
н^С-н /
сн
фенилаланин
ФАЛ
н
соон
I
с-н
бензойная кислота
салициловая кислота
коричная кислота
соон
С—н /
сн2
он
тирозин
Г
но^ЛТ
соон
4-гидроксифенил пируват
сно
но
4-гидроксифенил ацетальдегид
1_
но
ТАЛ
КН2
тирамин
но но
Ж2
дофамин
осн3
осн3
н
соон
I
с-н
флавоноиды
он
кумаровая кислота
соон
I
С-н
н
о.
он
сн3
феруловая кислота
соон
I
С-н
н3с
о
о.
3с он
синаповая кислота
сн3
берберин
Рис. 1. Биосинтез берберина и некоторых фенольных соединений (по [12, 13]).
лигнин
лигнин
пуляции, выращенного в ботаническом саду ВИЛАР [5].
Суспензионную культуру василистника выращивали на модифицированной МС-среде с 4%-ной сахарозой, 1 мг/л 2.4 Д и 0.5 мг/л кинетина [2]. Суспензию культивировали в колбах на качалке (100 об./мин) в темноте при температуре 25°С.
Соотношение инокулум : питательная среда - 1 : 10; для пересадок использовали 14-дневную культуру. 7 мМ Фен вносили после 7 дней выращивания. Концентрация и срок введения были подобраны ранее при изучении влияния различных аминокислот на продуктивность этой культуры василистника и являются оптимальными для увеличе-
Рис. 2. Влияние фенилаланина на активность ферментов ФАЛ и ТАЛ.
а - удельная активность ФАЛ, б - удельная активность ТАЛ. 1 - без Фен, 2 - 7 мМ Фен вводили на 7-е сутки выращивания. Представлены характерные результаты одного из 3 независимых экспериментов в двух биологических повторностях.
ния уровня алкалоидов [4]. Сухой вес клеток определяли после фильтрации биомассы через стеклянный фильтр и высушивания при 70°С до постоянной массы.
Содержание алкалоидов определяли методом прямого спектрофотометрирования при 415 нм на спектрофотометре Ultrospec 1000 ("Amer-sham", Великобритания) [3].
Общее содержание суммы растворимых фе-нольных соединений определяли спектрофотомет-рически с реактивом Фолина-Дениса при 727 нм, используя в качестве стандарта феруловую кислоту [6]. Фенольные кислоты, связанные с клеточной стенкой, после щелочного гидролиза анализировали на хроматографе Waters 510 (США) с UV-детектором при 320 нм, колонка - Luna 5u C18, 250 х 4.60 мм ("Phenomenex", США), скорость элю-ента (35-50%-ный ацетонитрил) 1 мл/мин [7].
Содержание белка определяли по Bradford [8].
Активность ФАЛ и тирозинаммиак-лиазы (ТАЛ) измеряли спектрофотометрически при 280 и 308 нм соответственно [9]. Удельную активность выражали в микромолях коричной (кума-ровой) кислоты, образующейся за 1мин на 1мг суммарного белка. Для очистки ФАЛ отфильтрованные клетки гомогенизировали с 0.2 М борат-ным буфером, 5 мМ ЭДТА, 20 мМ дитиотретола, рН 8.5 и центрифугировали при 12000 об./мин. Из супернатанта белок осаждали при 70%-ном насыщении (NH4)2SO4. Полученный осадок растворяли в 0.2 М боратным буфере, рН 8.5. Очистку проводили на DEАE-Sephacel в градиенте NaCl 0-0.4 M, Octylsepharose CL-4B - в градиенте этиленгликоля (0-30%) и Sephadex G200 [10]. Молекулярную массу субъединиц ФАЛ определяли с помощью SDS-электрофореза в 12%-ном ПААГ.
Антимикробную активность препаратов изучали на суточных культурах Staphylococcus au-
reus, Bacillus cereus, Escherichia colli, Pseudomonas aeruginosa и Candida albicans [11].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Ранее при изучении влияния аминокислот на продуктивность культуры василистника малого мы выявили, что после введения 7 мМ Фен в среду культивирования на 7-8-е сутки повышался выход берберина и увеличивалось содержание общих фенолов в 2 раза [4]. Анализ фенольных кислот, связанных с клеточной стенкой, показал увеличение феруловой, синаповой, кофейной кислот в 2.4, 2.6, 1.5 раза соответственно. Все эти изменения протекали на фоне ингибирования накопления сухой массы клеток. К концу культивирования различия между вариантами могли достигать 9-13%.
Предшественник протобербериновых алкалоидов - тирозин, а большая часть фенолов синтезируется из Фен. Первым ферментом, вовлекающим эту аминокислоту в их биосинтез через коричную и кумаровую кислоты, является ФАЛ (рис. 1). Кроме того, кумаровая кислота может синтезироваться из тирозина. В связи с этим определяли активности ФАЛ и ТАЛ при культивировании клеток василистника.
Активность ФАЛ достигала максимального значения к 6-8-м суткам культивирования, после чего снижалась, а после 14 суток опять плавно возрастала (рис. 2а). Сходные результаты были получены Smolko и Peretti на каллусной культуре Th. minus L. [1].
Активность ТАЛ возрастала в клетках до 10 суток и, после плавного снижения, повторно увеличивалась на 14-17-е сутки (рис. 26 ). Введение Фен в среду культивирования на 8-е сутки замедляло снижение активности ФАЛ (рис. 2а). Активность ТАЛ в противоположность ФАЛ после добавления Фен снижалась на 20% (рис. 26).
Анализ экстрактов из клеток после ионообменной хроматографии на DEАE-Sephacel выявил наличие двух белковых фракций (рис. 3), обладающих ферментативной активностью. Белок, выходящий при 0.1%-ном NaCl (Ф1), проявлял как ФАЛ, так и ТАЛ активность. Белок, выходящий при 0.4%-ном NaCl (Ф2), проявлял только ФАЛ активность. Дальнейшую очистку проводили на Octylsepharose CL-4B и G-200. Полученные ферментные препараты анализировали с помощью SDS-электрофореза в 12%-ном ПААГ, который показал наличие Ф1 с мол. м. 86 и 75 кД и Ф2 с мол. м. 90 (рис. 4).
По литературным данным [14], молекулярная масса ФАЛ, в зависимости от растительного источника, может колебаться в пределах 250-330 кД, а при распаде на 4 субъединицы у каждой из них находится в пределах 73-90 кД. На основании этого можно заключить, что Ф1 имеет мол. м. около
0.0020
^ 0.0004 0
Ф1/\\ к
lír^Mb i ki
Ф2
NaCl i i
0.4
58 70 81 93 № фракции
6 2 8 0.4
л
к н о ч к
W
а
о v
и
н к
О
Ф1
Ф2
Рис. 3. Профиль элюции экстракта из клеток васи-листника малого на DEAE-Sephаcel. Образец элюировали в градиенте №С1 (0-0.4 М). 1 -оптическая плотность при 280 нм, 2 - оптическая плотность при 595 нм, 3 - удельная активность ФАЛ, 4 - удельная активность ТАЛ. Представлены характерные результаты одного из 6 независимых экспериментов.
320 кД, а Ф2 - 360 кД. В цикле выращивания клеток василистника соотношение белков Ф1 и Ф2 менялось (данные не представлены). На 20-е сутки культивирования активность Ф2 практически отсутствовала. Экзогенный Фен приводил к интенсивному накоплению фенольных соединений, которые сильно препятствовали выделению белков
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.