научная статья по теме ВЛИЯНИЕ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКОГО РЕГУЛЯТОРА РОСТА РАСТЕНИЙ НА СТРУКТУРНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕМБРАН РАСТИТЕЛЬНОГО И ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ Биология

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКОГО РЕГУЛЯТОРА РОСТА РАСТЕНИЙ НА СТРУКТУРНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕМБРАН РАСТИТЕЛЬНОГО И ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ»

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 2, с. 128-134

УДК 576.311.5:577.352.236:577.352.334:581.1

ВЛИЯНИЕ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКОГО РЕГУЛЯТОРА РОСТА РАСТЕНИЙ НА СТРУКТУРНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕМБРАН РАСТИТЕЛЬНОГО И ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

© 2008 г. И. В. Жигачева, Л. Д. Фаткуллина, Е. Б. Бурлакова, А. Г. Шугаев*, И. П. Генерозова*, С. Г. Фаттахов**, А. И. Коновалов**

Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, 119334 г. Москва, ул Косыгина, 4; факс 137-41-01; электронная почта: zhigacheva@mail.ru;

*Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, г. Москва, ул. Ботаническая, 35; тел.: 903-93-40; электронная почта: ag-shugaev@ippras.ru **Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова Казанского научного центра РАН, Казань; факс (8432)73-18-72; электронная почта: mshulaeva@iopc.knc.ru Поступила в редакцию 29.05.2007 г.

После доработки 14.11.2007 г.

Сопоставлены эффекты низких доз регулятора роста растений мелафена на мембраны растительного и животного происхождения. Изучено влияние различных концентраций препарата (от 2 х 10-7 до 4 х 1012 М) на структурные характеристики мембран, прежде всего на микровязкость свободного липидного бислоя и аннулярных, связанных с белковыми кластерами, липидов мембран. Показано, что действующие концентрации мелафена для мембран растительного и животного происхождения различаются и носят дискретный характер: эффективной является либо концентрация 2 х 10-7 М, либо 4 х 1012 М в зависимости от типа и липидного компонента мембран. Параллельно изучали влияние мелафена на уровень продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в биологических мембранах в условиях внешних стрессовых воздействий. Показано, что препарат в концентрациях, оказывающих влияние на микровязкость свободных и аннулярных липидов мембран растительного и животного происхождения, снижает и интенсивность процессов ПОЛ. Предполагается, что влияние малых и сверхмалых концентраций препарата на структурное и функциональное состояние биологических мембран обусловлено его взаимодействием с сигнальными рецепторами в клеточных мембранах и органеллах растительного и животного происхождения.

В последнее время опубликованы работы, в которых изучали действие биологически активных веществ в малых и сверхмалых концентрациях. Эти работы проведены на системах различной сложности: организм, ткани, клеточные культуры, клеточные органеллы и биомакромолекулы [1-3]. К биологически активным веществам относятся природные фитогормоны и их синтетические аналоги, играющие важнейшую роль в регуляции метаболизма растений на всех этапах онтогенеза [46]. Уже синтезировано и найдено большое количество соединений, обладающих свойствами регуляторов роста растений [7-11]. Применение этих физиологически активных соединений дает возможность предотвратить полегание зерновых культур, ускорить прорастание семян и созревание плодов, способствует повышению урожайности и качества выращиваемой продукции, увеличивает устойчивость к действию патогенов и паразитов [7, 8, 11].

Однако применение природных регуляторов роста растений (фитогормонов) в сельскохозяйственной практике встречает ряд трудностей, связанных с высокой себестоимостью их получения и довольно быстрой потерей активности под влия-

нием различных факторов окружающей среды. В связи с этим проводится синтез и отбор препаратов, которые в малых и сверхмалых концентрациях способны активировать рост и улучшать качество получаемой продукции. К таким препаратам относится меламиновая соль бис(оксиметил)фос-финовой кислоты ("Мелафен"):

NH2 N

jy

H2N N" ^NH2

O

HOP(CH2OH)2

Препарат в очень низких концентрациях повышает урожайность ряда сельскохозяйственных культур [12, 13]. Известно, что мелафен в концентрации 3 х 10-9 М на 15% увеличивает скорость фотосинтеза и дыхания клеток растений [14].

Поскольку работа мембранных ферментов тесно связана с микровязкостью липидов в биологических мембранах, интересно было изучить влияние мелафена на микровязкость липидов в плазматических мембранах, мембранах митохондрий и микросом. Проведено сравнительное изучение влияния препарата на такие структурные характе-

ристики, как микровязкость свободных и аннуляр-ных липидов в объектах растительного и животного происхождения.

Представлялось важным также изучить влияние мелафена на уровень свободных радикалов в биологических мембранах, выделенных из растений и животных контрольной группы, а также из растений и животных, подвергнутых стрессовым воздействиям. В качестве индикатора интенсивности протекания в мембранах свободно-радикальных реакций использовали уровень продуктов пе-рекисного окисления липидов (ПОЛ).

Цель настоящей работы состояла в выявлении систем клетки, которые изменяются под влиянием малых и сверхмалых доз мелафена.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Работу проводили на мембранах эритроцитов, микросом и субмитохондриальных частиц (СМЧ), выделяемых из печени мышей линии SHK по методу [15], а также на мембранах митохондрий из корнеплодов сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) [16] и митохондриях из печени крыс [17].

Митохондрии выделяли из печени крыс и из запасающей паренхимы сахарной свеклы методом дифференциального центрифугирования [18] по стандартной методике [16, 17]. Белок определяли биуретовым методом.

Структурные характеристики мембран растительного и животного происхождения изучали с помощью ЭПР-спектроскопии с использованием спиновых зондов. В качестве зондов использовали стабильные нитроксильные радикалы, синтезированные в Институте химической физики РАН, согласно [19, 20]. Микровязкость различных областей липидного бислоя мембран оценивали по времени вращательной корреляции включенных в мембрану спиновых зондов: 2,2,6,6-тетраметил-4-каприлоилоксипиперидин-1-оксила (зонд I) и 5,6-бензо-2,2,6,6-тетраметил-1,2,3,4-тетрагидро-у-кар-болин-3-оксила (зонд II), которые различаются по своей локализации в белково-липидных мембранах:

СНз

-O

СНз

Н

Зонд II

СтИх^СО

Зонд I

Согласно [21], зонд I преимущественно локализуется в свободном липидном бислое мембран на расстоянии 2-4 А от поверхности, а зонд II - в зоне липидов, связанных с белковыми доменами (анну-лярными липидами). Препарат мелафен в концентрации 2 х 10-7-4 х 10-12 М добавляли в суспензию мембран (3-5 мг белка/мл) и инкубировали в течение 30 или 90 мин при 4°С. Контролем служили

пробы мембран без препарата. Затем в суспензию мембран вводили зонд, конечная концентрация которого была 10-5 М, и инкубировали в течение 30 мин при температуре 4°С. Спектры регистрировали на ЭПР-спектрометре ER-200D SRC ("Bruk-er", ФРГ) при комнатной температуре. Из полученных спектров по формулам для быстровращаю-щихся зондов рассчитывали время вращательной корреляции зондов (тс х 10-10 с), имеющее смысл периода переориентации радикала на угол п/2 [22]. Результаты выражали в относительных единицах.

Изучали также влияние мелафена на скорость окисления аскорбата + ТМФД (тетраметилфени-лендиамина) ферментами дыхательной цепи митохондрий печени крыс и митохондрий из корнеплодов сахарной свеклы.

Скорость дыхания митохондрий регистрировали кислородным электродом типа Кларка, используя полярограф LP-7 (Чехия).

Скорость переноса электронов в дыхательной цепи митохондрий печени определяли при 28°С в среде инкубации следующего состава: 0.2 М сахароза, 10 мМ трис-HCl, 2 мМ КН2Р04, 5 мМ MgSO4, 10 мМ КС1, 10 мМ аскорбат, 6 х 10-6 М ротенон, 8 х 10-7 М антимицин А, 10-6 М FCCP, рН 7.5. Для митохондрий сахарной свеклы использовали среду, содержащую 0.4 М сахарозу, 20 мМ HEPES-трис-буфер (рН 7.2), 5 мМ КН2Р04, 4 мМ MgC12, 10 мМ аскорбат, 6 х 10-6 М ротенон, 5 мкМ антимицин А, 0.5 мкМ FCCP (температура 28°С).

Влияние мелафена на уровень ПОЛ изучали на митохондриях печени интактных крыс и крыс, подвергнутых холодовому стрессу. Опыты проводили также на препаратах свежевыделенных митохондрий из корнеплодов сахарной свеклы, хранившихся в стандартных условиях, и суспензии искусственно "состаренных" митохондрий (хранившихся в течение 5 ч при 10°С). Крыс подвергали холодовому стрессу, выдерживая их в воде с температурой 2°С до тех пор, пока их ректальная температура не снижалась с 37.6 до 33°С. Перед декапита-цией крыс содержали в течение 30 мин при комнатной температуре [23, 24]. Митохондрии инкубировали в течение 30 мин без мелафена или с мелафеном в концентрации 2 х 10-7 М-4 х 10-12 М.

Уровень ПОЛ оценивали флуоресцентным методом [25]. Экстракцию липидов из мембран митохондрий проводили в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком. Липиды экстрагировали из 3-5 мг митохондриального белка смесью хлороформ : метанол 2 : 1 (по объему). Соотношение митохондрии : смесь хлороформ-метанол = 1 : 10. Митохондрии гомогенизировали в течение 1 мин при температуре 10°С. Затем к смеси добавляли равный объем дистиллированной воды, быстро смешивали и переносили в 12-мл центрифужные стаканы. (Промывание водой необходимо для уда-

Таблица 1. Относительное изменение микровязкости липидного бислоя мембран при действии мелафена в разных концентрациях*

Мембраны Время инкубации, мин Зонд Мелафен, М

2 х 10-7 2 х 10-9 1 х 10-11 4 х 10-12

Эритроциты 30 I 0.73 0.78 0.8 0.93

II 1.03 1.15 1.09 1.18

90 I 1.09 1.14 1 1.02

II 1.19 1.25 1.15 1.35

СМЧ печени 30 I 0.94 1.07 1.07 0.99

II 1.13 1.15 1.3 1.38

90 I 1.07 1.02 0.78 0.76

II 0.93 1.09 1.15 1.47

Микросомы печени 30 I 1.02 1.05 1.08 1.01

II 1.11 1.09 1.2 1.21

90 I 0.84 0.78 0.86 0.92

Митохондрии II 1.36 1.15 1.29 1.4

сахарной свеклы 30 I 0.98 1.17 1 0.9

II 1.34 1.13 1.03 1.06

* Данные представлены в виде отношения опыт/контроль.

ления флавиновых компонентов, имеющих максимум флуоресценции в области 520 нм.) Центрифугировали в течение 5 мин при 600 g. Отбирали 1 мл хлороформенного (нижнего) слоя и добавляли 0.1 мл метанола. Флуоресценцию регистрировали в 10-мм кварцевых микрокюветах объемом 1.4 мл на спектрофлуориметре "Hitachi MPF-4" (Япония). В качестве контроля использовали хлороформ (1 мл), к которому добавляли 0.1 мл метанола.

Длина волны возбуждения флуоресценции -360 нм, испускания - 420-470 нм.

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком