РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2013, том 53, № 6, с. 583-591
= РАДИАЦИОННАЯ ЦИТОГЕНЕТИКА =
УДК [57+61]::539.1.04:614.875:575.224.23
ВЛИЯНИЕ ФРАКЦИОНИРОВАННОГО УФ-С-ОБЛУЧЕНИЯ НА ИЗМЕНЕНИЕ ПРОФИЛЯ МЕТИЛИРОВАНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНО РАЗЛИЧНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНК И ВЫХОД НЕСТАБИЛЬНЫХ ХРОМОСОМНЫХ АБЕРРАЦИЙ У ПРОРОСТКОВ КУКУРУЗЫ
© 2013 г. А. П. Кравец*, Д. А. Соколова, Г. С. Венгжен, Д. М. Гродзинский
Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, Украина
На основании двух показателей — изменения профиля метилирования транскрибируемой и сател-литной ДНК, а также выхода нестабильных хромосомных аберраций, исследовано повышение резистентности проростков кукурузы при фракционированном УФ-С-облучении. Установлены изменения в профиле метилирования транскрибируемых и сателлитных частей ДНК, а также в выходе хромосомных аберраций, зависящие от интервала между фракциями облучения. Статистический анализ изменений цитогенетических показателей указывает на существование двух стратегий репо-пуляционного восстановления меристемы в пострадиационный период. Обсуждается роль взаимодействия тканевых и внутриклеточных процессов в формировании системного отклика организма на стресс, результатом которого является изменение резистентности организма в целом.
Резистентность проростков, хромосомные аберрации, профиль метилирования ДНК, транскрибируемая ДНК, сателлитная ДНК.
БО1: 10.7868/80869803113060064
Исследование развития реакции организмов на повторяющиеся воздействия находится в центре внимания ряда биологических и медицинских дисциплин. В радиобиологии этот вопрос широко исследуется при изучении эффектов фракционированного облучения и адаптивного ответа. Несмотря на богатый экспериментальный материал, полученный в этих исследованиях, системные механизмы изменения радиоустойчивости — как ее повышения (адаптации), так и снижения (радиосенсибилизации) остаются малоизученными. Современная радиобиология располагает обширными данными о конститутивных и индуци-бельных механизмах защиты и восстановления биологических систем от радиационных воздействий [1, 2]. Однако потенциал каждого из них и взаимосвязь в формировании пострадиационного системного ответа остается мало изученной. Принципиальными из важнейших факторов, обусловливающих как сложность самих процессов изменения устойчивости, так и методологических вопросов их изучения, являются иерархичность и многосвязность биосистем. Каждый из уровней организации организмов обладает собственными механизмами реагирования на
* Адресат для переписки: Украина, 03022 Киев, ул. Василь-ковская, 31/17, Ин-т клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, отдел радиобиологии; e-mail: kaplibra@gmail.com.
действие повреждающего фактора. Клеточный уровень, например, — интенсификацией антиок-сидантных и репарационных процессов [1, 2], по-пуляционный и тканевой — репопуляцией [3, 4]. Вместе с тем они интегрированы в целостную систему отклика на стресс, результатом которой является изменение резистентности организма в целом.
Один из возможных подходов к оценке включения индуцибельных механизмов и их роли в изменении радиочувствительности биологических систем связан с изучением изменений профилей метилирования транскрибируемых и сателлит-ных последовательностей ДНК. Известно, что метилирование, как единственная форма кова-лентной модификации ДНК без изменения ее нуклеотидной последовательности, является одним из основных эпигенетических механизмов контроля генной экспрессии [5—7]. Вместе с тем метилирование является полифункциональным процессом, играя значительную роль в конфор-мационных изменениях ДНК, активизации мобильных элементов и инициирования геномной нестабильности [5, 6]. Таким образом, повышение надежности оценки биологической роли изменений профилей метилирования возможно при соотнесении этих изменений с поведением других реакций организма на радиационное воздействие.
Данное сообщение посвящено изложению результатов, полученных при изучении связи изменения профиля метилирования в функционально различных последовательностях ДНК и выхода хромосомных аберраций при фракционированном УФ-С-облучении проростков кукурузы. Исследованы различные интервалы между фракциями с целью оценки динамических особенностей изменений радиоустойчивости, что в свою очередь позволяет оценить основные ее механизмы, а также пути их интеграции.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Исследование проводили на 3—7-дневных проростках кукурузы, сорт Титан. Семена проращивали на поддонах с увлажненной фильтровальной бумагой, в термостате при температуре +23— 24°С. 3-суточные проростки подвергали фракционированному УФ-С-облучению в суммарных дозах 6.2—9.0 кДж/м2 (длина волны 253 нм, мощность дозы — 6.2 Вт/м2), с фракциями 3.1, 3.6, 4.5 кДж/м2 и с различными временными интервалами — 1 ч, 4 ч и 1 сут. Использован облучатель бактерицидный ОБН-150М (Украина) с лампами Philips Special TUV 30 W
В данном сообщении будут приведены иллюстративные материалы, относящиеся к данным, полученным при облучении в 7.2 кДж/м2 .
Материалом для цитогенетических исследований была апикальная меристема корня. Отбор проб для цитогенетического анализа проводили на 1-е, 2-е, 3-и, 4-е сут после облучения. После отделения от корня апексы помещали в фиксатор Бродского (уксусная кислота : этиловый спирт : : формалин = 0.3 : 1 : 3) на 2 ч. Затем отмывали 70%-ным этиловым спиртом (3—4 смены). Мацерацию проводили с помощью щелочного гидролиза 20%-ного NaOH на протяжении 2 ч. Затем препараты 15 мин отмывали дистиллированной водой. Окраску проводили смесью ацетоарсеина и соляной кислоты (ацетоарсеин : 1 моль/л HCl = = 1 : 1) в течение 16—18 ч. Окрашенный материал промывали 45%-й CH3COOH, затем готовили давленые препараты. Использовали по 10 параллельных проб и анализировали по 5—10 тыс. клеток. Учитывая специфику растительных тканей, определение хромосомных аберраций проводили анофазно-телофазним методом. При этом выборка клеток в анафазе каждого препарата составляла не менее 300—350.
Выделение ДНК проводили из побегов 6-су-точных проростков кукурузы СТАБ — методом [8], модифицированным для данной культуры. Депротеинизацию проводили смесью фенол : : хлороформ в соотношении 1 : 1 [9, 10].
Измерения концентрации полученного раствора ДНК проводили на спектрофотометре Bio-
Photometer Plus Eppendorf v. 1.35 с использованием стандартной методики [11].
ПЦР проводили в четырехканальном ДНК-амплификаторе "Терцик" ("ДНК-технология", Москва). Использованы праймеры к минисател-литным последовательностям ISSR (inter simple sequence repeat 15-soro, последовательность — 5'-АС-АС-АС-АС-АС-АС-АС-АС-<С>-3'), а также праймеры к транскрибируемым последовательностям ITS1(internal transcribed spacer 1, последовательность - 5'-ТCC-GTA-GGT-GAA-CCT-GCG-G-3'), и ITS4 (internal transcribed spacer 4, последовательность — 5'-ТCC-TCC-GCT-TAT-TGA-TAT-GC-3'). Оба типа праймеров синтезированы фирмой "Metabion" (Германия).
Реакционная смесь для ISSR-PCR объемом 50 мкл содержала: 1.25 ед. Taq-полимеразы (recombinant) (0.8 мкл), 5 мкл 10 х Taq-Buffer, 4 ммоль/л MgCl2 (8 мкл), 0.2 ммоль/л каждого dNTP (1 мкл смеси динуклеотидтрифосфатов), 0.5 цмоль/л праймера (1.5 мкл), 1.5 мкг тотальной геномной ДНК (5 мкл), 28.7 мкл деионизирован-ной воды. Смесь покрывали 20 мкл вазелинового масла [12].
Амплификация с ISSR-праймерами включала следующие этапы: начальная денатурация 5 мин при 94°С, 40 циклов; денатурация при 94°С — 45 с, температура отжига 52°С — 45 с, элонгация при 72°С — 90 с; конечная элонгация продолжалась 7 мин при 72°С [13].
Реакционная смесь для ITS-PCR объемом 50 мкл содержала: 1.25 ед. Taq-полимеразы (recombinant) (0.8 мкл), 5 мкл 10 х Taq-Buffer, 4 ммоль/л MgCl2 (8 мкл), 0.2 ммоль/л каждого dNTP (1 мкл смеси), 0.5 цмоль/л каждого праймера (по 2 мкл), 1.5 мкг тотальной геномной ДНК (5 мкл), 26.2 мкл деионизированной воды. Смесь также покрывали 20 мкл вазелинового масла.
ПЦР при использовании ITS-праймеров включала следующие этапы: начальную денатурацию в течение 1.5 мин при 94°С, 5 циклов; далее следуют дополнительно 40 циклов денатурации при 94°С — 15 с; отжиг при температуре 55°С — 15 с и элонгация при 72°С — 15 с. Затем — "закрепление": денатурация при 94°С — 10 с, температура отжига 55°С — 10 с; элонгация при 72°С — 10 с; конечная элонгация 5 мин при 72°С [12].
Реакции рестрикции, как и амплификацию, проводили в четырехканальном ДНК-амплифи-каторе "Терцик" ("ДНК-технология", Москва). Использовали два типа рестриктаз — изошизоме-ров: HpaII и MspI и рестриктазу MboI ("Fermentas", Германия) (таблица). Пользовались стандартным протоколом проведения рестрикцион-ного анализа фирмы-поставщика.
Реакционная смесь для рестрикционного анализа HpaII, объемом 25 мкл, содержала 0.2 ед. фермента (0.3 мкл), 2.0 мкл 10 х Buffer Tango,
1.5 мкг общей геномной ДНК (5 мкл), 17.7 мкл деионизированной воды. Смесь покрывали 20 мкл вазелинового масла.
Реакция рестрикции с ферментом MspI проходила в объеме 25 мкл, содержала 0.6 ед. фермента (0.9 мкл), 2.0 мкл 10 х Buffer Tango, 1.5 мкг тотальной геномной ДНК (5 мкл), 17.1 мкл деионизированной воды. Смесь покрывали 20 мкл вазелинового масла.
Реакционная смесь для рестрикционного анализа MboI, объемом 25 мкл, содержала 0.2 ед. фермента (0.3 мкл), 2.0 мкл 10 х Buffer Tango, 1.5 мкг общей геномной ДНК (5 мкл), 17.7 мкл деионизированной воды. Смесь покрывали 20 мкл вазелинового масла.
Условия проведения реакции рестрикции: 16 ч при 37°С, остановка реакции — 20 мин при 65°С (для HpalI и MboI) и 20 мин при 80°С (для MspI).
Полученные продукты ПЦР и рестрикцион-ного анализа разделяли в 1.0%-ном агарозном геле с ТБЕ (трис-борат-ЕДТА) — буфером в присутствии бромистого этидия и визуализировали на UV-трансиллюминаторе. При постановке электрофореза в карманы геля вносили одинаковый объем (10 мкл) продуктов ПЦР и рестрикции. В качестве маркера молекулярного веса использовали FastRuler High Range DNA Ladder (Fermentas), с фрагментами длиной 10000, 4000, 2000, 1000 и 500 пар нуклеотидов, и FastRuler Low Range DNA Ladder (Ferment
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.