УДК 577.114.7;615.322;547.917
ВЛИЯНИЕ ФУКОИДАНОВ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ НА ПРОТИВООПУХОЛЕВУЮ И ФАГОЦИТАРНУЮ АКТИВНОСТЬ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА
© 2015 Н.Ю. Анисимова1, Н.Е. Устюжанина2, Ф.В. Доненко1, М.И. Билан2, Н.А. Ушакова3, А.И. Усов2, Н.Э. Нифантьев2, М.В. Киселевский1*
1 Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина, 115478Москва, Каширское шоссе, 24; факс: +7(499)324-2794, электронная почта: kisele@inbox.ru
2 Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН, 119991 Москва, Ленинский пр., 47; факс: +7(499)135-5328, электронная почта: nen@ioc.ac.ru
3 Институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, 119121 Москва, ул. Погодинская, 10, стр. 8; факс: +7(495) 245-0857
Поступила в редакцию 26.12.14 После доработки 28.03.15
Проведено исследование иммунотропной активности структурно различных фукоиданов и их производных по отношению к изолированным иммунокомпетентным клеткам крови, являющихся эффекторами врожденного иммунного ответа. Наибольшую активность продемонстрировал высокомолекулярный фукоидан CF из водоросли Chordaria flagelliformis, основная цепь которого построена из (1^3)-связанных остатков a-L-фукопиранозы, а боковые заместители включают остатки a-D-глюкуроновой кислоты и a-L-фукофу-ранозы. Это соединение в концентрации 0,05 мг/мл стимулировало фагоцитоз Saccharomyces cerevisiae и Lactobacillus acidophilus нейтрофилами, увеличивая как относительное количество фагоцитов, так и их эффективность. При этом было отмечено возрастание концентрации мембраносвязанных молекул интегрина CD11c на 14%. Воздействие CF на системном уровне в дозе 0,01 мг/мышь внутрибрюшинно приводило к усилению противоопухолевой цитотоксической активности мононуклеарных лейкоцитов селезенки против клеток меланомы линии В16 в 1,9 раза и против клеток эритромиелобластного лейкоза линии К-562 в 1,7 раза. Полученные данные свидетельствуют о способности фукоидана CF стимулировать противоинфекци-онную и противоопухолевую активность эффекторов врожденного иммунитета при участии интегринов CD11c.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: фукоиданы, лейкоциты, натуральные киллеры, фагоцитоз, цитотоксичность.
Сульфатированные полисахариды фукоиданы из бурых водорослей вызывают интерес благодаря проявляемой ими биологической активности, такой как антикоагулянтная, антитром-ботическая, противовоспалительная, противо-
Принятые сокращения: НК — натуральные киллеры, SL — высокомолекулярный фукоидан из водоросли Saccharina latissima, CF — высокомолекулярный фукоидан из водоросли Chordaria flagelliformis, PPdX — дексилозили-рованный низкомолекулярный фукоидан из водоросли Punctaria plantaginea, OS — синтетический полностью суль-фатированный октасахарид, ДМСО — диметилсульфок-сид, ФИ — фагоцитарный индекс, ФЧ — фагоцитарное число, MFI — средняя интенсивность флуоресценции, НСТ — нитросиний тетразолий, КМ — клетки-мишени, МЛ — мононуклеарные лейкоциты, КЭ — клетки-эффекторы, ИЦА — индекс цитотоксической активности.
* Адресат для корреспонденции.
опухолевая, противовирусная и др. [1—4]. На основе таких биомолекулярных систем [5], как фукоиданы, могут быть разработаны эффективные фармацевтические препараты для лечения целого ряда социально-значимых заболеваний. В настоящее время фукоиданы рассматриваются как один из наиболее перспективных классов природных соединений для разработки иммуно-модулирующих агентов, поскольку они наряду с широким спектром иммунотропных свойств характеризуются относительно низкой токсичностью. Механизм иммуностимулирующего действия фукоиданов связывается, прежде всего, с их способностью активировать фагоциты и индуцировать продукцию цитокинов, таких как фактор некроза опухоли-а, интерлейкин-6 и интерлейкин-8 [1, 4, 6, 7]. Эти эффекты приво-
1099
10*
дят к стимуляции натуральных киллеров (НК), а также Т-клеток, что сопровождается повышением их цитотоксической активности по отношению к трансформированным клеткам, а также высвобождением интерферона-у и интерлей-кина-12. Кроме того, фукоиданы способны вызывать активацию и созревание антигенпрезен-тирующих дендритных клеток [8].
Фукоиданы, продуцируемые разными видами водорослей, существенно различаются строением и спектром биологической активности [9—12]. Целью настоящего исследования являлась оценка воздействия структурно различных фукоиданов и их производных на активность иммунокомпетентных клеток крови, являю-
РРс)Х
Рис. 1. Основные структурные характеристики
щихся эффекторами врожденного иммунного ответа. Были изучены два высокомолекулярных фукоидана из водорослей Басскаппа Ша^зша [13] и Скогйапа /1а£еШ/огт1в СБ [14], дексилози-лированный низкомолекулярный фукоидан РРёХ [15] из водоросли Рып^апа plantaginea и синтетический полностью сульфатированный октасахарид 08 [16]. Основные структурные характеристики исследованных сахаридов представлены на рис. 1, а содержание моносахаридов и сульфата указано в табл. 1. В качестве биообъектов были выбраны натуральные киллеры и нейтрофилы, которые проявляют противоопухолевую и противоинфекционную активность соответственно.
ОН СР
ОРг
оэ
исследованных фукоиданов и их производных
Таблица 1. Состава исследованных поли- и олигосахаридов
Образец Источник Fuc Xyl Man Gal UA6 so-3 DSB
CF [14] C. flagelliformis 40,1 - - 1,7 13,5 26,6 0,8
SL [13] S. latissima 36,7 1,8 0,7 8,4 1,9 39,8 1,3
PPdX [15] расщепление по Смиту фукоидана из P. planta-ginea 60,2 - - 1,5 - 27,4 0,7
OS [16] синтез из L-фукозы 39,4 - - - - 59,1 2,0
а Содержание (w/w, %) моносахаридов и сульфата. б Уроновые кислоты.
в Степень сульфатирования рассчитана как молярное отношение сульфата к сумме моносахаридов (Fuc + Xyl + Gal + UA).
Ранее нами было проведено исследование антикоагулянтной, противовоспалительной и антиангиогенной активностей для ряда структурно различных фукоиданов [9]. Интервал активных концентраций полисахаридов составил 10—100 мкг/мл, в связи с этим в настоящем исследовании мы использовали схожие количества сахаридов.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследованные поли- и олигосахариды. Высокомолекулярные фукоиданы из водорослей видов Б. ШаНззта и С. flagelliformis СБ выделяли, как описано ранее [13, 14]. Полисахарид РРёХ получали дексилозилированием нативно-го фукоидана из водоросли вида Р. plantaginea [15]. Полностью сульфатированный октасаха-рид 08 синтезировали из Ь-фукозы [16]. Содержание моносахаридов и сульфата в исследованных сахаридах указано в табл. 1. Для приготовления рабочих (стоковых) растворов навески поли- и олигосахаридов (5,0 мг) были растворены сначала в диметилсульфоксиде (ДМСО) (1 мл), а затем в стерильном 0,9%-ном растворе хлорида натрия (9 мл).
Исследование фагоцитарной активности нейт-рофилов. Для исследований использовали кровь клинически здоровых доноров, стабилизированную гепарином (20 ед/мл) или 3,8%-ным цитратом натрия в соотношении 9 : 1. Кровь (0,9 мл) в течение 3 ч инкубировали с растворами исследуемых образцов (0,1 мл) при 37° на возвратно-поступательном шейкере при 250 об/мин. Конечная концентрация образцов сульфатирован-ных сахаридов составляла 0,05 мг/мл. В контрольной серии экспериментов к стабилизированной крови (0,9 мл) добавляли 0,9%-ный
раствор NaCl (0,1 мл), содержавший 10%-ный ДМСО.
Для изучения фагоцитоза с помощью световой микроскопии в качестве объектов фагоцитоза использовали суспензии Saccharomyces cere-visiae (дрожжи вида S. cerevisiae) и Lactobacillus acidophilus (штамм бактерий L. acidophilus N.V.EP 317/402 «Наринэ» ТНСи), которые инкубировали с престимулированной фукоиданами кровью в течение 45 мин [17]. Готовили мазок, окрашивали его по Романовскому—Гимзе и проводили микроскопию с масляной иммерсией. В каждом мазке подсчитывали не менее 100 нейт-рофилов, вычисляя фагоцитарный индекс (ФИ) — процент клеток, содержащих фагоцитированные объекты, а также фагоцитарное число (ФЧ) — количество поглощенных одним фагоцитом бактерий или дрожжей [18].
Исследование фагоцитарной активности нейтрофилов крови за счет кислородзависимого киллинга E. coli проводили с использованием набора реагентов FagoFlowEx Kit («EXBIO Diagnostics», Чехия) методом проточной цито-метрии. Популяцию нейтрофильных лейкоцитов выделяли при помощи гейтирования по параметрам малоуглового и бокового светорассеяния. Результаты регистрировали на канале флуоресценции FL1 (FITC) цитофлуориметра BD Canto II («Becton Dickinson», США). Затем в соответствии с инструкцией производителя проводили оценку средней интенсивности флуоресценции (MFI — от англ. mean fluorescence intensity, усл. ед) фагоцитов, которая отражает уровень активации отдельного нейтрофила.
Для изучения активации кислородзависимых механизмов фагоцитоза использовали спектро-фотометрический вариант теста восстановления нитросинего тетразолия (НСТ). Принцип метода основан на учете количества диформазана,
восстановленного фагоцитами из НСТ. Эта химическая реакция осуществляется благодаря активации кислородзависимой биоцидности фагоцитов. НСТ-тест проводили в двух вариантах: спонтанном и стимулированном [18]. В качестве стимулятора использовали суспензию дрожжей S. cerevisiae и кисломолочных бактерий L. acidophilus. Кровь в течение 3 ч инкубировали с растворами исследуемых фукоиданов при 37° на возвратно-поступательном шейкере при 200 об/мин, а затем еще 1,5 ч с микроорганизмами в тех же условиях. Концентрация образца сульфатиро-ванного сахарида составляла 0,05 мг/мл. Затем добавляли раствор НСТ и инкубировали еще 45 мин. Результат учитывали, измеряя оптическую плотность раствора на планшетном сканере MS Multiscan («Multiscan», Финляндия) при 540 нм.
Определение концентрации лейкоцитов с фенотипом CD45+CD66b+CD1^+. Использовали антитела к CD45, CD 11c, CD66b человека, конъюгированные с флуорохромами («Becton Dickinson», США). После инкубации крови с антителами эритроциты лизировали реагентом OptiLyse («Immunotech», Франция), затем клетки отмывали фосфатно-солевым буфером. Фенотип лейкоцитов оценивали методом проточной цитометрии на цитофлуориметре BD Canto II («Becton Dickinson», США). В каждом образце анализировали не менее 10 000 клеток. Популяцию нейтрофилов последовательно гейтировал
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.