БИОФИЗИКА КЛЕТКИ= =
УДК 577.353.22
ВЛИЯНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ P АЗГР УЗКИ И ДЕФИЦИТА ДИСТРОФИНА НА ЛОКАЛЬНУЮ ГИПЕРПОЛЯРИЗАЦИЮ ПОСТСИНАПТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ СКЕЛЕТНОГО МЫШЕЧНОГО ВОЛОКНА
© 2010 г. В.В. Кравцова, Б.С. Шенкман*, В.М. Михайлов**, Е.Е. Никольский***, И.И. Кривой
Санкт-Петербургский государственный университет, 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9; *Государственный научный центр РФ — Институт медико-биологических проблем РАН, 123007, Москва; **Институт цитологии РАН, 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий просп., 4; *** Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН, 420111, Казань E-mail: 1^огКг[уо[@1К4251.&рЪ.ейи Поступила в p едакцию 23.06.10 г.
Получены данные, подтвер ждающие общность электрогенного механизма гипер поляризующего действия наномолярных концентраций холинергических лигандов во внесинаптическом районе и эндогенного неквантового ацетилхолина в синаптическом районе скелетного мышечного волокна. Показано, что этот механизм в обоих случаях реализуется чер ез вовлечение а2-изо-формы ^+К+-АТФазы и функционирует в отсутствие входа натрия чер ез каналы мембраны. Вместе с тем имеются особенности, проявляющиеся при функциональных нарушениях. Так, эффективность данного механизма в синаптическом районе мембраны селективно увеличивается при вывешивании задних конечностей кр ысы и снижается в условиях дефицита дистрофина у мышей шёх. Последнее позволяет предположить, что дистрофин является молекулярным компонентом, необходимым для функционирования электрогенного механизма локальной гиперполяризации мембраны концевой пластинки.
Ключевые слова: скелетная мышца, мембранный потенциал покоя, изоформы Na+K+ -АТФазы, уабаин, функциональная разгрузка, дистрофин, мыши mdx.
Известно, что величина трансмембранной разности потенциалов в разных отделах покоящегося скелетного мышечного волокна варьирует. Так, постсинаптическая мембрана интакт-ных скелетных мышечных волокон млекопитающих гиперполяризована на 2-4 мВ по ср ав-нению с внесинаптической, что рассматривается как важный механизм структурно-функциональной организации нервно-мышечного синапса [1,2]. Есть веские о снования считать, что пр и-чиной локальной гиперполяр изации постсинап-тической мембраны является повышение электр огенной активности Ка+К+-АТФазы за счет ее активации ацетилхолином (АХ), выделяющимся из моторного нер вного окончания и из мышечных волокон в неквантовой форме [2-4]. Экспериментальные данные и расчеты показали, что в результате постоянного неквантового освобождения в синаптической щели даже при
Сокращения: АХ - ацетилхолин, АХЭ - ацетилхолин-эстераза, нХР - никотиновые холинорецепторы, МПКП -миниатюрные потенциалы концевой пластинки.
активной ацетилхолинэстеразе (АХЭ) поддерживается концентрация ацетилхолина, достигающая 50 нМ [2-4]. Установлено, что аналогичная по величине гиперполяризация развивается и во внесинаптической сарколемме при действии наномоляр ных концентраций экзогенного ацетилхолина или никотина. П роведенные эксперименты показали, что этот эффект реализуется за счет увеличения электрогенной активности а2-изоформы Ка+К+-АТФазы и со хр аня-ется в условиях блокады входа ионов натрия через открытые каналы никотиновых холино-рецепторов (нХР) [5-7]. По ряду данных гипер-поляризующее действие ацетилхолина может реализовываться как за счет его прямого действия на Ка+К+-АТФазу [4], так и за счет функциональной и молекулярной связи между Ка+К+-АТФазой и никотиновыми холиноре-цепторами [6].
Остается неизвестным, является ли механизм гиперполяризующего действия наномолярных концентраций холинергических лигандов во
внесинаптической мембране идентичным механизму локальной постсинаптической гиперполяризации за счет неквантового ацетилхолина. В частности, какая изоформа ^+К+-АТФазы участвует в эффекте неквантового ацетилхолина, какова роль в этом эффекте входящего в волокна натрия. Неизвестно, что происходит с механизмом локальной гиперполяризации в условиях функциональной разгрузки, которая селективно снижает электрогенную активность а2-изоформы Ка+К+-АТФазы внесинаптической мембраны [8]. Отличается ли эффект разгрузки от др угих функциональных нарушений, например, денервации, устраняющей локальную гиперполяризацию [2-4]. Наконец, какова возможная роль в механизме локальной гиперполяризации дистрофина, важного компонента дистрофинового гликопротеинового комплекса и постсинаптического скаффолда [9].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты проводили на изолированных нервно-мышечных препаратах диафрагмы или m. soleus самцов белых крыс линии Вистар (масса 180-200 г), мышей дикого типа C57B1/6 (масса около 22 г) и мышей тёх (масса около 27 г). Мыши тёх были подарены пр оф. Т .А. Партриджем (T.A. Partridge, Hammersmith Hos-рка1, London) чл.-корр. РАМН B.C. Баранову и содержались в виварии Института цитологии РАН. Условия содержания животных и пр иемы работы с ними соответствовали нор мам международного и ро ссийского законодательства.
Сразу после выделения полоску левой полудиафрагмы шириной 10-15 мм с входящим в нее нервом или m. soleus с отрезком нерва помещали в экспериментальную камеру с проточным физиологическим раствором следующего со става (в мМ): NaCl - 137,0; KCl - 5,0;
СаС12 - 2,0; MgCl2 - 2,0; NaHCO3
24,0;
NaH2PO4 - 1,0; глюкоза - 11,0 (pH 7,4). В части опытов пр оизводили замену NaCl на N-methyl-d-glucamine chloride (NMG-Cl, Sigma, США). Раствор постоянно аэрировали карбогеном (95% O2 + 5% CO2), температура раствора составляла 28°С. Перед началом эксперимента мышцы выдерживали в этих условиях в течение 60 мин.
Величину мембранного потенциала покоя Vm регистр ир овали внутриклеточно с помощью стеклянных микроэлектродов с внутренними капиллярами (BF150-110-10, Sutter Instrument, Co., СШA), изготовленных на микрокузнице Sutter Р-97 ^ШA). Микроэлектроды заполняли 3 М раствор ом К Cl, их сопротивление составляло менее 10 мОм, собственный потенциал кончика
Рис. 1. Влияние безнатриевого раствора и добавления никотина (100 нМ) на Ут мышечных волокон диафрагмы крысы во внесинаптическом (светлые столбики) и в синаптическом (темные столбики) районах; ** р < 0,01 - различие между указанными районами мембраны.
не превышал нескольких милливольт. Cpазу после введения микроэлектрода в мышечное волокно нажатием кнопки формировался синхроимпульс, который запускал аналого-цифровой преобразователь и автоматическую регистрацию Vm. После этого микроэлектрод выводили из волокна, и подобную процедур у регистр ации Vm быстро повторяли в 25-35 волокнах. В части опытов регистрировали миниатюрные потенциалы концевой пластинки (МПКП). Регистр ир овали максимальную амплитуду МПКП, время нарастания (10-90% от максимальной амплитуды), длительность полуспада. Полоса пропускания усилителя при регистрации МПКП составляла 0,1-3000 Гц, частота оцифровки - 44100/с.
В опытах применяли уабаин, никотин и NMG-Cl. Для статистической обработки применяли программу ORIGIN 6.1. В тексте и на рисунках приведены средние значения величин с их ошибками.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБCУЖДЕНИЕ
Pоль входа натрия в поддержании постсинаптического электрогенеза. Величина Vm в синаптическом районе мышечных волокон диафрагмы крысы (пять мышц) в нормальном физиологическом растворе составила -81,5 ± 0,4 мВ (154 волокна), что на 3,5 ± 0,6 мВ (p < 0,01) негативнее по сравнению с внесинаптиче-ским районом (-78,0 ± 0,4 мВ, 184 волокна) этих же мышц (р ис. 1). Чер ез 2 ч после замены NaCl в омывающем растворе на NMG-Cl величина Vm в обоих районах волокон не изменялась и величина локальной гиперполяризации постсинаптической мембраны сохр анялась. Если через 60 мин после замены NaCl на NMG-Cl добавляли никотин (100 нМ), то чер ез 60 мин
его действия наблюдали гиперполяризацию вне-синаптической мембраны величиной около 4 мВ (р < 0,01). Величина Ут постсинаптической мембраны при этом не изменялась. В результате в присутствии никотина величина Ут в обоих районах мышечной мембраны выравнивалась и не отличалась от Ут постсинаптической мембраны в контроле (рис. 1).
Как установлено ранее, локальная гиперполяризация синаптической мембраны вызывается неквантовым ацетилхолином, постоянно присутствующим в синаптической щели в наномо-лярном диапазоне концентраций и активирующим Ка+К+-АТФазу [2-4]. Аналогичная гиперполяризация величиной около 4 мВ, обусловленная увеличением электрогенной активности Ка+К+-АТФазы, наблюдается и во внесинап-тической мембране при добавлении в раствор наномоляр ных концентраций ацетилхолина или никотина [5-7].
Гиперполяризующее действие холинергиче-ских лигандов могло бы осуществляться за счет активации Ка+К+-АТФазы ионами Ка+, входящими через потенциалзависимые Ка-каналы [2] и/или открытые каналы нХР. Ранее было показано, что после добавления 100 нМ никотина или ацетилхолина в раствор вначале наблюдается быстро проходящая фаза слабой деполяризации и лишь затем фаза устойчивой гиперполяризации внесинаптической мембраны [6,7]. Поскольку константа активации нХР для ацетилхолина составляет десятки мкМ [10], начальная фаза деполяризации при действии 100 нМ ацетилхолина может свидетельствовать об открывании незначительной фракции нХР. На фоне блокатора открытого ионного канала нХР проадифена (5 мкМ) начальная фаза деполяризации полностью исчезала, тогда как динамика и величина гиперполяризующего эффекта не изменялись [7]. Эти данные позволяют предпо-ложить, что гипер поляризация, вызываемая экзогенным ацетилхолином или никотином во вне-синаптической мембране, развивается и при блокаде ионных токов через открытый канал нХР.
В данной работе мы пытались выяснить, влияет ли вход Ка+ в мышечное волокно на локальную гиперполяризацию, вызываемую эндогенным неквантовым ацетилхолином в си-наптическом районе. Установлено, что после замены КаС1 в растворе на КМв-С1 величина локальной гиперполяризации постсинаптиче-ского района сохранялась (рис. 1). В присутствии КМв-С1 добавление 100 нМ никотина вызывало гиперполяризацию внесинаптической мембраны величиной около 4 мВ. Таким образом, гиперполяризация, вызываемая наномо-лярными концентрациями ацетилхолина или
никотина в синапт
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.