АГРОХИМИЯ, 2010, № 3, с. 44-51
УДК 632.4:631.46:633.321
ВЛИЯНИЕ ФУЗАРИОЗНОЙ ИНФЕКЦИИ НА ИЗМЕНЕНИЕ ПОЧВЕННОГО МИКРОМИЦЕТНОГО КОМПЛЕКСА ПОСЕВА КЛЕВЕРА КРАСНОГО (ЛУГОВОГО)
© 2010 г. И.Г. Широких, А.А. Широких, Е.Г. Арзамасова, И.А. Устюжанин,
Р.И. Абубакирова
Зональный научно-исследовательский институт сельского хозяйства Северо-Востока
им. Н.В. Рудницкого РАСХН 610007 Киров, ул. Ленина, 166а, Россия E-mail: irgenal@mail.ru
Поступила в редакцию 11.02.2009 г.
Изучен количественный и качественный состав почвенных микроскопических грибов посева клевера красного (лугового) (Trifolium pratense L.) в связи с селекцией растений на устойчивость к фузариозным корневым гнилям. Выявлены изменения численности грибных пропагул и видового состава микроми-цетов, сопряженные с выживаемостью и продуктивностью растений. Уменьшению поражения грибами корней клевера лугового способствовала предпосевная бактеризация семян клубеньковыми бактериями Rhizobium leguminosarum bv. trifolii. Средняя радиальная скорость роста мицелия грибов Fusarium, изолированных из пораженных корней растений, была больше, а способность к продукции ИУК существенно не отличалась от аналогичных показателей видов грибов, выделенных из почвы ризосферы. Ключевые слова: фузариозная инфекция, клевер красный (луговой), почва, микромицеты, ауксины, скорость роста.
ВВЕДЕНИЕ
Высокая значимость культуры клевера красного (лугового) (Trifolium pratense L.) обусловлена его кормовыми достоинствами как белковой культуры, относительно низкой энергоемкостью выращивания, а также сохранением и повышением почвенного плодородия, благодаря обогащению почвы азотом и улучшению ее фитосанитарного состояния. Однако с конца 1970-х годов прошлого века супрессивность почв под клеверами и другими многолетними бобовыми травами [1-3] заметно уменьшается, что связано, по-видимому, с общим ухудшением экологической обстановки в агроцено-зах. Культура клевера все чаще становится накопителем корневых инфекций, особенно вызываемых грибами рода Fusarium [4, 5].
Необходимым условием фитосанитарной стабилизации в посевах многолетних бобовых трав является селекция устойчивых сортов, в том числе путем проведения отборов на искусственном инфекционном фоне [6-8]. Критерием эффективности искусственного инфекционного фона является конечный результат - уровень корневых заболеваний, приводящих к выпадению растений и уменьшению урожайности. Не менее важны данные о влиянии искусственного внесения в почву инфекционного материала на микобиоту прикорневой зоны растений.
Поскольку грибы рода Fusarium не являются обли-гатными паразитами и для них характерна большая изменчивость физиолого-биохимических признаков [9], в целях повышения эффективности использования в селекции искусственного фузариозного фона необходим отбор грибных штаммов, обладающих свойствами r-стратегов [10], которые могут активно колонизировать поверхность корней за счет интенсивного роста и, секретируя в растительные ткани различные физиологически активные соединения, обеспечивать успешное развитие болезни.
Цель работы - оценка воздействия искусственной фузариозной инфекции на количественный и качественный состав почвенных микромицетов в посеве клевера красного (лугового), а также сравнительное изучение способности к биосинтезу ауксинов и величины радиальной скорости роста фузариозных изолятов из пораженных корней и почвы ризосферы.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Численность и состав микромицетов в прикорневой зоне клевера лугового изучали в 2007-2008 гг. в полевом опыте, заложенном на дерново-подзолистой почве, характеризующейся следующими показателями: рН 4.2-4.4, гидролитическая кислотность 5.5-5.9 мг-экв/100 г, содержание P2O5 - 161-196 и КО - 171-216 мг/кг почвы.
Объектом исследования служили сорта клевера красного (лугового) Дымковский посева 2006 г. (2-й и 3-й годы жизни) и Кудесник посева 2007 г. (2-й год жизни). Сорт Дымковский - среднеранний, двуукосного типа, сочетающий высокий потенциал продуктивности сухого вещества (12.6 т/га) и семян (7.0 ц/га) с зимостойкостью и высокой адаптивностью. Сорт Кудесник - раннеспелый, двуукосный, средняя урожайность сухого вещества - 11.9 т/га, семян - 2.7 ц/га. По пораженности корневыми гнилями оба сорта относятся к средне-устойчивым.
Перед посевом семян в почву вносили размолотую зерносмесь (60 г/м2), инфицированную выделенными из больных растений грибами Fusarium culmorum (W.G. Smith.) Sacc., F. oxysporum Schlecht.: Fr., F. avenacium (Fr.:Fr.) Sacc. в равных соотношениях по массе [11] для создания искусственного инфекционного фона. В одном варианте семена до посева дополнительно были обработаны суспензией (107 КОЕ/мл) клубеньковых бактерий Rhizobium leguminosarum bv. trifolii штамм 348, в другом варианте бактеризацию не проводили. Контролем служил вариант без внесения инфекционного ино-кулюма и бактеризации семян.
Образцы корней с почвой отбирали 7 июня 2007 г., 19 мая и 16 сентября 2008 г. (сорт Дымковский); 19 мая и 16 сентября 2008 г. (сорт Кудесник).
Для анализа использовали свежие образцы. В стерильных условиях с помощью скальпеля и пинцета осторожно счищали излишки почвы с корней, оставляя лишь слой, не превышающий по толщине 3 мм. Затем стерильно вырезали сегменты корней (на 2-3 см ниже шейки корня). Из каждого образца брали навеску корней с прилипшей к ним почвой (2 г), помещали в 100 мл стерильной водопроводной воды и взбалтывали 3-5 мин со стерильными металлическими отбойниками. Из полученной суспензии (ризосферы) извлекали корни. Для получения образца ризопланы отмытые корни стерильно растирали в ступке и доводили объем гомогената до 100 мл стерильной водой. Сухую массу корней и почвы определяли гравиметрически после фильтрования через бумажный фильтр и высушивания при 105 °С.
Качественный состав типичных микромицетов ризосферной почвы и ризопланы клевера лугового определяли при посеве разведений суспензий на твердую среду Чапека со стрептомицином (100 мг/л), который добавляли для ингибирования роста бактерий. Чашки с посевами инкубировали в течение 10-14 сут при комнатной температуре. Дифференцированно учитывали колонии по морфологическим типам. Доминирующие на каждой чашке типы колоний выделяли в чистую культуру и изучали
морфологические и культуральные признаки грибов в соответствии с определителями [12, 13].
Для прямого выявления фитопатогенных грибов поверхностно обработанные спиртом сегменты корней с видимыми поражениями помещали в чашки Петри с агаризованной средой и культивировали при 27°С в течение 3-5 сут. Грибы рода Fusarium определяли по ключу Билай [9].
У представителей рода Fusarium, выделенных из больных корней и ризосферной почвы, определяли способность к синтезу индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) и радиальную скорость роста. Биосинтез ИУК изучали, выращивая культуры в жидкой среде Чапека с добавлением 200 мкг/мл триптофана в качестве предшественника ауксинов. Посевной материал выращивали 4-5 сут на плотной среде того же состава, инокулят в виде агаровых дисков с мицелием (5 шт. диаметром 6 мм) вносили в 50 мл среды в колбы объемом 250 мл и инкубировали в течение 2 нед при 28°С. Мицелий отделяли от среды центрифугированием в течение 10 мин (6000 об./мин). Ауксины из подкисленной (HCl до рН 2.5-3.0) культуральной жидкости экстрагировали равным объемом этилацетата. Сухие остатки после упаривания этилацетатных экстрактов растворяли в 80%-ном этаноле [14]. Анализ ИУК в пробах проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) на приборе фирмы Shimadzu (модель LC-20AD). Детекция ауксинов: УФ-де-тектор SPD-20A при 280 нм. В качестве элюента использовали смесь вода-ацетонитрил-уксусная кислота в соотношении 83:17:0.2 (по объему) [15]. Использовали колонку Discoveri С18 (Supelco) из нержавеющей стали размером 250 х 4 мм (размер частиц 5 мкм). Образец перед введением в колонку пропускали через ультратонкий нейлоновый фильтр (Iso-Disc) с размером пор 0,45 цм. Скорость подачи элюента 0.9 мл/мин, температура колонки 33°С. Для построения калибровочного графика использовали разведения стандартного раствора ИУК ("Fluca", Швейцария).
Определение радиальной скорости (Kr) роста грибов Fusarium проводили, выращивая культуры на картофельной среде при температуре 28°С. Каждый изолят выращивали в 10 повторностях. Динамику роста грибов оценивали на 3-и и 7-е сут после посева. Измеряли суточный прирост диаметра колоний в двух взаимно перпендикулярных направлениях. Радиальную скорость роста колоний рассчитывали по формуле:
Kr = (d2 - d1)/(t2 -
где d1 и d2 - диаметр колонии (мм) в начальный и конечный моменты измерения соответственно; t1 и t2 - время (сут) начального и конечного измерения.
Вегетативную совместимость использованных при создании инфекционного фона культур грибов F. culmorum К 159 и F. oxysporum Kret с изолята-ми грибов, полученными из пораженных корней и почвы ризосферы, изучали при сращивании образуемых ими колоний на сусло-агаре. Визуально сравнивали характер пограничных зон в месте срастания. Отсутствие антагонистического ответа (образования валика, барража, пигментации) трактовали в пользу идентичности (клонального происхождения) штаммов.
Эффективность использования искусственного инфекционного фона для отбора устойчивых форм клевера красного (лугового) оценивали по урожайности его надземной биомассы и уменьшению выживаемости растений.
Статистическую обработку данных проводили стандартными методами с помощью встроенного статистического пакета EXCEL (MS Office 2007).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
На естественном инфекционном фоне (в контрольном варианте) уровень корневых заболеваний, приводящих к выпадению растений, изменялся в зависимости от сорта незначительно: выживаемость растений сорта Кудесник составила 90 и 87%, Дымковский - 90 и 84% в зависимости от года жизни растений (табл. 1). В результате внесения в почву фузариозной инфекции выживаемость растений уменьшилась в различной степени: на 14-25% - у сорта Кудесник и на 7-8% - у сорта Дымковский. Продуктивность выживших на искусственном инфекционном фоне растений была существенно
меньше по
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.