ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 5, с. 738-743
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ВЛИЯНИЕ ГЕНОТИПА РАСТЕНИЯ И БАКТЕРИАЛЬНОГО ШТАММА Agrobacterium tumefacience НА АГРОБАКТЕРИАЛЬНУЮ ТРАНСФОРМАЦИЮ Brassica oleracea var. capitata
© 2007 г. Т. Сретенович-Раджичич*, С. Нинкович**, Б. Юзелак**, Б. Винтерхальтер**, Д. Винтерхальтер**
*Группа исследования разнообразия геномов, Институт генетики культурных растений,
Гатерслебен, Германия **Отдел физиологии растений, Институт биологии, Белград, Сербия Поступила в редакцию 10.01.2007 г.
Две инбредные линии Brassica oleracea L. var. capitata были трансформированы с помощью двух штаммов Agrobacterium tumefaciens (AGL1/p DM805 и LBA4404/p GKB5 (LB5-1)) для повышения устойчивости к гербициду баста. При инокуляции бактерией семядолей и гипокотилей получали нормальные растеньица, характеризующиеся высокой степенью регенерации на MC-среде с добавлением 1 мг/л БАП и 0.5 м г/л индолил-3 масляной кислоты. У растений генотипа P34I5 по сравнению с генотипом P22I5 отмечали более высокую степень регенерации побегов (соответственно 48.1 и 26.9%), интенсивность размножения и акклимации в теплице (соответственно 76 и 40%). Штамм A. tumefaciens AGL1/p DM805 и ндуцировал образование большего числа побегов на экспланте, особенно в случае инокуляции семядолей, и более высокую степень трансформации, чем штамм LB5-1 (соответственно до 35 и 12%). Подвергнутые трансформации растения выживали после опрыскивания фосфинотрицином в концентрации 10-30 мг/л. Трансформацию подтверждали GUS-тестом (по ß-глюкуронидазе) и полимеразной цепной реакцией (ПЦР) в поколениях Т0 и Т1.
Brassica oleracea var. capitata - Agrobacterium tumefaciens - ген bar - трансформация - GUS-тест
ВВЕДЕНИЕ
В роду Brassica насчитывается большое количество видов, представляющих интерес для сельского хозяйства, и на них активно изучаются возможности генетической трансформации с использованием Agrobacterium. Вслед за первой работой [1] вскоре появились и другие сообщения [2-6]. Наибольший интерес вызвали сообщения о повышении у трансформированных растений капусты устойчивости к гербицидам [7, 8], патогенам [9] и насекомым-вредителям [10].
В группе Brassica была продемонстрирована высокая степень зависимости успешной трансформации от генотипа растений [11, 12], что создает трудности при использовании стандартных процедур. В нашей предыдущей работе был описан протокол простого, быстрого и высоко эф-
Сокращения: ОС - основная среда, СРП - среда для регенерации побегов, ИМК - индолилмасляная кислота, ПЦР - по-лимеразная цепная реакция, GUS - Р-глюкуронидаза, L-PPT -фосфинотрицин (баста).
Адрес для корреспонденции: S. Ninkovic. Department of Plant Physiology, Institute for Biological Research "S. Stankovic", Bulevar Despota Stefana 142, 11000 Belgrade, Serbia. Fax: (+381) 11 2761 433; e-mail: slavica@ibiss.bg.ac.yu
фективного способа повышения устойчивости са-войской капусты (Brassica oleracea var. sabauda) к гербициду баста® с использованием A. tumefaciens [13].
В настоящей работе мы представили результаты экспериментов, в которых был использован тот же протокол в применении к капусте двух генотипов. Обсуждается зависимость успеха трансформации от генотипа растений и бактериальных штаммов.
МЕТОДИКА
Растительный материал, инокуляция и регенерация растений. Опыты проводили на растениях капусты (Brassica oleracea L. var. capitata) двух ин-бредных линий (P34I5 и P22I5) селекции Центра сельскохозяйственных культур (Смедеревска Паланка, Сербия). Семена стерилизовали 20 мин в 15%-ном коммерческом отбеливателе (4% NaOCl), тщательно отмывали автоклавированной водой и проращивали в МС-среде [14] с добавлением 2% сахарозы и 0.64% агара (основная среда, ОС).
Сегменты 10-дневных побегов помещали на 48 ч в ОС с добавлением 1 мг/л БАП и 0.5 мг/л ин-долилмасляной кислоты (ИМК) (среда для регенерации побегов, СРП), затем на 10-15 мин в сус-
пензию Agrobacterium, после чего отмывали в течение 20 мин в растворе Tolycar (500 мг/л, цефотаксим, "Jugoremedija", Сербия), обсушивали фильтровальной бумагой и снова помещали на СРП [13]. Через 2 дня экспланты переносили на СРП с добавлением 500 мг/л цефотаксима и суб-культивировали на ней, постепенно снижая концентрацию цефотаксима через каждые 6 нед. (100 —» 50 —► 0 мг/л ). При первом субкультивировании в СРП добавляли 2 мг/л AgNO3. Регенерированные побеги размножали на ОС с добавлением 0.5 мг/л БАП и 0.1 мг/л ИМК и укореняли на ОС с добавлением 4 мг/л ИМК и 4% сахарозы.
Бактериальные штаммы и подтверждение трансформации. В работе использовали два штамма A. tumefaciens: AGL1/pDM805 [15] и LBA4404/pGKB5 (LB5-1) [16]. Плазмиды обоих штаммов содержат ген bar, ответственный за повышение устойчивости трансформированных растений к фосфинот-рицину (L-PPT), гербициду с коммерческим названием баста®. Кроме того, в плазмидах содержится ген uidA (ген ß-глюкуронидазы, GUS) - выявляемый гистохимически маркер трансформации, и ген nptII (в штамме LB5-1), определяющий устойчивость к канамицину.
Устойчивость к гербициду оценивали после культивирования побегов в среде, содержавшей 0.5, 2 или 10 мг/л L-PPT, или после их опрыскивания раствором L-PPT (10 мг/л). Растения, выращиваемые в теплице, опрыскивали L-PPT в концентрациях 3.75-30 мг/л.
Трансформанты, инокулированные штаммом LB5-1, проверяли на устойчивость к канамицину в среде, содержавшей 25 мг/л препарата.
Наличие GUS экспрессии определяли гистохимическим методом (метод X-gluc-окрашивания [17]). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с использованием праймеров, ампли-фицирующих фрагмент кодирующей области uidA длиной в 3660 п.н. [13]. Геномную ДНК выделяли из листьев предполагаемых трансформантов, используя метод CTAB-экстракции [18]. ПЦР проводили при следующих условиях: 95°С 4 мин, а затем 39 циклов амплификации (денатурация при 95°С 1 мин; отжиг при 55°С 2 мин; полимеризация при 72°С 3 мин) в Techne амплификаторе (Великобритания). Продукты ПЦР визуализировали в УФ-свете после электрофореза в 1%-ном агарозном геле и окрашивания бромидом этидия.
Статистический анализ. При обработке данных о росте побегов и сравнении ростовых параметров у эксплантов, образовавшихся из гипоко-тилей и семядолей, использовали /-критерий Стьюдента. Представлены средние данные трех независимых экспериментов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Растения дикого типа двух инбредных линий B. oleracea var. capitata (P34I5 и P22I5), использованные в экспериментах, обладали высокой активностью каллусообразования и высоким регенераци-онным потенциалом у эксплантов из гипокотилей и семядолей (табл. 1). Однако экспланты из гипокотилей обоих генотипов регенерировали побеги интенсивнее; линия P34I5 регенерировала побеги интенсивнее, чем линия P22I5 (соответственно 68.5 и 35.0%).
Экспланты обоих линий, инокулированные A. tumefaciens, также демонстрировали высокую степень регенерации (от 23.3 д о 48.1%), которая у инокулированных LB5-1 семядольных эксплантов линии P34I5 оказалась даже выше, чем у контрольных растений (табл. 1). Необходимо отметить, что на семядольных эксплантах образовывалось очень большое количество побегов, особенно после инокуляции штаммом AGL1/p DM805 (табл. 1, рис. 1а). В предыдущей работе [13] у са-войской капусты была отмечена более высокая степень регенерации (42.3-71.4%), причем у гипо-котильных эксплантов она была выше. Напротив, регенерация побегов из "бородатых" корней после трансформации с помощью A. rhizogenes, штамм A4M70GUS, у других генотипов капусты протекала интенсивнее, чем у савойской капусты [19].
Обработка AgNO3 (2 мг/л) или канамицином (25 мг/л) отрицательно сказывалась на регенерации побегов, снижая процент регенерирующих эксплантов и количество побегов на инокулированных эксплантах. Мы подтвердили полученные ранее данные на савойской капусте [13] о том, что AgNO3 в этой концентрации снижает эффективность регенерации побегов и каллусообразования, хотя наши данные и противоречат выводам других исследователей [7, 20].
Побеги, регенерированные из инокулированных эксплантов, при культивировании на среде размножения, содержавшей 0.5 мг/л БАП и 0.1 мг/л ИМК, росли интенсивнее, и их было больше, чем при культивировании эксплантов дикого типа (табл. 2). У растений генотипа P34I5, трансформированных штаммом AGL1/pDM805, эффективность ростовых процессов была выше, чем у других растений. С другой стороны, у регенерантов LB5-1 наблюдали спонтанное корнеобразование, чего не было у регенерантов AGL1/pDM805. Серьезным недостатком регенерантов AGL1/pDM805 явилась сильная склонность к витрификации.
Различия в эффективности трансформации у двух штаммов A. tumefaciens, несущих одинаковый ген bar, ответственный за устойчивость к гербициду баста®, и ген GUS, были очевидны. Штамм AGL1/pDM805 был гораздо эффективнее, чем LB5-1. У эксплантов савойской капусты инокуля-
Таблица 1. Регенерация побегов на эксплантах двух генотипов B. oleracea L. var. capitata, инокулированных штаммами AGL1/pDM805 и LB5-1 A. tumefaciens, через 35 дней после их помещения на среду регенерации
Штамм Генотип Число эксплантов Ag Канамицин Экспланты с каллусом, % Экспланты с побегами, % Число побегов на экспланте
Г С Г С Г С Г С
AGL1/pDM805 P34I5 309 360 - - 32.0 21.1 39.1 23.3 3.9 ± 0.12* 11.6 ± 1.70*
238 254 + - 1.1 0 2.4 11.8 1.0 ± 0.05 2.9 ± 0.25
P22I5 301 383 - - 2.7 44.1 26.9 23.5 2.8 ± 0.46 6.6 ± 0.59
220 366 + - 1.6 23.9 6.2 9.6 1.0 ± 0.08 2.8 ± 0.18
LB5-1 P34I5 330 309 - - 33.3 33.3 42.9 48.1 2.0 ± 0.18 6.4 ± 0.92
317 307 + + 0 21.3 4.1 16.7 1.0 ± 0.25 2.0 ± 0.63
327 246 - + 0 22.8 13.8 25.0 1.0 ± 0.22 3.1 ± 0.87
P22I5 293 267 - - 14.3 6.7 25.8 23.7 2.9 ± 0.65 5.3 ± 0.95
260 307 + - 0 1.8 16.7 3.6 1.0 ± 0.33 1.0 ± 0.08
208 290 - + 11.1 0 1.2 12.5 1.0 ± 0.14 1.0 ± 0.12
Контроль P34I5 41 37 - - 92.7 83.3 65.8 25.0 3.8 ± 0.50* 2.5 ± 0.37
P22I5 46 38 - - 54.3 100 35.0 22.9 1.3 ± 0.46 0.8 ± 0.12
Примечание. Среда регенерации содержала 1.0 м г/л БАП и 0.5 мг/л ИМК с добавлением 25 мг/л канамицина или 2.0 мг/л AgNOз или без них. Г - гипокотиль; С - семяд
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.