РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2010, том 4(13), № 3, с. 243-247
= ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ =
ВЛИЯНИЕ р-ГЕПТИЛГЛИКОЗИДА МУРАМИЛДИПЕПТИДА НА АЛЬТЕРАТИВНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПЕЧЕНИ И ПРОЛИФЕРАЦИЮ СПЛЕНОЦИТОВ И ТИМОЦИТОВ МЫШЕЙ С ГЕПАТИТОМ, ИНДУЦИРОВАННЫМ КОНКАНАВАЛИНОМ А
© 2010 г. Ж.Б. Понежева, С.С. Обернихин, О.В. Калюжин, А.В. Караулов*
НИИ морфологии человека РАМН, Москва, Россия;
*ГОУВПО Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова, Москва, Россия
Поступила: 01.06.2010. Принята: 25.09.2010
На модели экспериментального гепатита, индуцированного конканавалином А, у мышей Ба1Ь/е изучено влияние р-гептилгликозида мурамилдипептида на динамику морфологических изменений печени, а также пролиферативную активность тимоцитов и спленоцитов. Профилактическое внутрибюшинное введение гликопептида в дозе 1 мг/кг предотвращало, а в дозе 0,2 мг/кг уменьшало некротические изменения печени и дистрофию гепатоцитов, вызванных конканавалином А. Сходное, но менее выраженное гепатопротективное действие обнаружено при инъекции р-гептилгликозида мурамилдипептида на фоне уже развивающегося экспериментального гепатита. При обоих вариантах введения гликопептид подавлял пролиферацию тимоцитов на третьи сутки эксперимента и стимулировал ее на седьмые сутки. Значимого изменения пролиферации спленоцитов на модели гепатита не выявлено.
Ключевые слова: р-гептилгликозид мурамилдипептида, гепатит, конканавалин А, гистология, пролиферация
ВВЕДЕНИЕ
Высокая заболеваемость вирусными гепатитами в большинстве стран мира и резистентность к известным противовирусным средствам возбудителей гепатита В и С (ИБУ и ИСУ) делают эту проблему значимой не только в медицинском, но и в социальном отношении. В России распространённость ИБУ-инфекции составляет 6%, а НСУ-инфекции — 3% [1, 2]. Доказана ключевая роль клеточных иммунных реакций в патогенезе вирусных гепатитов [3, 4, 5]. В связи этим большое значение приобретает разработка методов иммунотерапии гепатитов, направленных как на стимуляцию противовирусной защиты, так и на снижение выраженности воспалительного процесса в печени.
Среди иммунотропных субстанций, потенциально пригодных для использования в комплексном лечении вирусных гепатитов, выделяются производные мурамилдипепти-да (МДП), благодаря способности стимулировать основные звенья противовирусного
Адрес: 117418, г. Москва, ул. Цюрупы, д. 3, НИИ морфологии человека РАМН. E-mail: kalyuzhin@list.ru
иммунного ответа [6, 7]. Следует отметить, что эти вещества могут усиливать выработку морфина и кодеина в различных регионах центральной нервной системы и периферических тканях, снижая выраженность синдрома отмены [8], что представляет интерес в связи с высокой частотой ассоциации гепатитов В и С с наркотической зависимостью. Кроме того, мурамилпептиды усиливают противоопухолевый ответ [9], что a priori должно снизить риск развития гепатоцеллюлярного рака — одного из неблагоприятных исходов хронических вирусных гепатитов.
Одним из наиболее биологически активных соединений из этой группы является р-геп-тилгликозид МДП (С7МДП) [10]. Он оказался мощным стимулятором основных звеньев противоопухолевого и противоинфекционно-го иммунитета в модельных тест-системах in vitro и in vivo [11, 12]. Выявлена способность С7МДП in vivo активировать продукцию ИЛ-1р, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12, ФНОа, ИФНа и ИФНу [13, 14]. На моделях in vivo показано, что этот глико-пептид модулирует клеточный и гуморальный иммунитет [15]. У больных хроническим гепатитом С С7МДП снижал вирусную нагрузку и активность трансаминаз в сыворотке крови
[7]. Доказано, что некоторые мурамилпепти-ды обладают гепатопротективным действием [16]. Морфологического подтверждения наличия такого эффекта у С7МДП не получено.
Широкое распространение получило моделирование гепатита на лабораторных животных. Одной из наиболее адекватных представляется модель гепатита, индуцированного конканавалином А (Кон А) [17]. Целью данной работы было изучение влияния С7МДП на динамику морфологических изменений печени, а также функциональное состояние клеток тимуса и селезёнки мышей Balb/c при гепатите, вызванном Кон А.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Животные
В опытах использовали мышей-самцов инбредной линии Balb/c массой тела 18 — 20 г, полученных из филиала «Столбовая» ГУ Научного центра биомедицинских технологий РАМН. Животных содержали в пластмассовых клетках на естественной диете в виварии НИИ морфологии человека РАМН.
в-Гептилгликозид мурамилдипептида
Р-Гептилгликозид N-ацетилмурамил^-аланил^-изоглутамина (С7МДП) синтезирован по методу [18] и любезно предоставлен для экспериментальных исследований профессором кафедры органической химии Таврического национального университета им. В.И. Вернадского (г. Симферополь, Украина) А.Е. Земляковым.
Моделирование гепатита и схема опытов
Для индукции гепатита животным под эфирным наркозом внутривенно вводили Кон А («Pharmacia», Швеция) в дозе 10 мг/кг массы тела в 200 мкл физиологического раствора. С7МДП вводили внутрибрюшинно в дозах 0,04 мг/кг, 0,2 мг/кг и 1 мг/кг в 200 мкл 0,9% раствора NaCl либо за 2 часа до, либо через 2 часа после инъекции Кон А. Мышам контрольной группы вводили внутрибрюшинно 200 мкл 0,9% раствора NaCl за 2 часа до инъекции Кон А. Отдельную группу составляли мыши, которым внутрибрюшинно вводили только С7МДП в дозах 0,04 мг/кг, 0,2 мг/кг и 1 мг/кг в 200 мкл 0,9% раствора NaCl. Животных забивали на третьи и седьмые сутки после введения КонА под эфирным наркозом методом цервикальной дислокации. Выде-
ляли печень для морфологических исследований, а также селезенку и тимус для функциональных тестов. Для суждения о норме для морфологических и иммунологических исследований в работе использовали органы, выделенные у интактных мышей, не подверженных каким-либо воздействиям.
Морфологические исследования и функциональные тесты
Печень фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, после стандартной гистологической обработки срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Выделенные общепринятыми методами суспензии спленоцитов и тимоцитов инкубировали в 96-луночных планшетах по 2,5 х 106 клеток на лунку в 200 мкл среды RPMI 1640, содержащей 5% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 10 мМ буфера HEPES («Flow Laboratories», Великобритания), 5 х 10-5 М 2-меркаптоэтано-ла («Serva», Германия) и 50 мкг/мл гентами-цина («Unique Pharmatheutical Laboratories», Индия) при 37 °С в атмосфере увлажненного воздуха с 5% СО2. Спонтанную пролифе-ративную активность спленоцитов и тимо-цитов определяли в стандартном 4-часовом тесте с включением 3Н-тимидина [19] c использованием p-спектрометра («LKB Wallac», Швеция).
Статистическая обработка материала
Математическую обработку полученных данных проводили с помощью программы Sta-tistica 7.0. Для оценки достоверности различий сравниваемых показателей использовали [/-критерий Манна-Уитни. Различие считали достоверным при p < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Влияние С7МДПна динамику альтеративных изменений печени при экспериментальном гепатите
Строение печени, выделенной у мышей на третьи и седьмые сутки после введения только С7МДП во всех дозах, практически не отличалось от такового у интактных животных, не подверженных каким-либо воздействиям.
При морфологическом исследовании печени мышей, которым вводили только Кон А в дозе 10 мг/кг, на третьи сутки эксперимента определялись обширные очаги некроза, выраженные дистрофические изменения гепато-цитов (рис. 1а). Внутрибрюшинная инъекция
6
Норма 3 сутки 7 сутки
I ИС7МДП И Кон А Щ Кон А + С7МДП |
Рис. 2. Действие 0,2 мг/кг С7МДП на пролиферацию спленоцитов мышей при введении через 2 часа после внутривенной инъекции 10 мг/кг Кон А. *p > 0,05 в сравнении с нормой (пролиферацией спленоцитов интактных животных);
+ p < 0,05 в сравнении с пролиферацией спленоцитов, выделенных у мышей после введения только 0,2 мг/кг С7МДП.
Норма 3 сутки 7 сутки
I ИС7МДП H Кон А Щ Кон А + С7МДП |
Рис. 3. Действие 0,2 мг/кг С7МДП на пролиферацию ти-моцитов мышей при введении через 2 часа после внутривенной инъекции 10 мг/кг Кон А. *р < 0,05 в сравнении с нормой (пролиферацией тимо-цитов интактных животных);
+ p < 0,05 в сравнении с пролиферацией тимоцитов, выделенных у мышей после введения только 0,2 мг/кг С7МДП;
#p < 0,05 в сравнении с пролиферацией тимоцитов, выделенных у мышей после введения только 10 мг/кг Кон А.
С7МДП в дозе 1 мг/кг за 2 часа до введения Кон А полностью предотвращала развитие некротических поражений печени, при этом на третьи сутки эксперимента отмечался лишь незначительный анизоцитоз гепатоцитов и увеличение числа неэпителиальных клеточных элементов (рис. 1б). В гистологических препаратах печени мышей, которым профилактически вводили С7МДП в дозе 0,2 мг/кг, выявлены мелкие очаги некрозов (по 5—10 клеток) и значительные дистрофические изменения гепатоцитов (рис. 1в). При введении Кон А после внутрибрюшинной инъекции исследуемого мурамилпептида в дозе 0,04 мг/кг в печени обнаружены обширные очаги некроза и выраженные дистрофические изменения гепатоцитов (рис. 1г).
На седьмые сутки после инъекции Кон А в контрольной группе степень дистрофии клеток печени была значительно ниже в сравнении с третьими сутками эксперимента, отмечены анизоцитоз гепатоцитов и выраженная реакция неэпителиальных клеточных элементов. В группе мышей, получивших профилактически 0,04 мг/кг С7МДП, в это время гистологическая картина сильно не отличалась от контрольной группы. Тогда как печень животных, которым превентивно вводили 0,2 или 1 мг/кг мурамилпептида, имела в целом нормальное строение.
Сходные дозозависимые эффекты по подавлению альтеративных изменений в печени выявлены и при введении С7МДП на фоне
уже развивающегося экспериментального гепатита. Однако выраженность биологического действия мурамилпептида была несколько ниже, чем в случае его профилактического введения.
Влияние С7МДПна пролиферацию клеток селезенки и тимуса
После внутрибрюшинного введения мышам только С7МДП в дозе 0,2 мг/кг на третьи сутки обнаружена тенденция к снижению пролиферативной активнос
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.