НЕЙРОХИМИЯ, 2011, том 28, № 3, с. 200-207
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 612.821.6
ВЛИЯНИЕ ГЕРОПРОТЕКТОРНЫХ ПЕПТИДОВ НА АКТИВНОСТЬ ХОЛИНЭСТЕРАЗ И ОБРАЗОВАНИЕ РАСТВОРИМОЙ ФОРМЫ ПРЕДШЕСТВЕННИКА АМИЛОИДНОГО ПЕПТИДА В КЛЕТКАХ НЕЙРОБЛАСТОМЫ ЧЕЛОВЕКА SH-SY5Y
© 2011 г. Н. Н. Наливаева1'2' *, Н. З. Макова2, Е. Г. Кочкина1, Д. Джон2, В. А. Арутюнов3, Л. С. Козина3, А. В. Арутюнян3, И. А. Журавин1
Учреждение Российской академии наук Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН,
Санкт-Петербург, Россия 2Институт молекулярной и клеточной биологии Университета г. Лидс, Великобритания 3Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, Россия
Снижение когнитивных способностей с возрастом является результатом дегенерации холинергиче-ских нейронов и дефицита ацетилхолина в определенных структурах мозга. В связи с этим ингибиторы холинэстераз, способные предотвращать снижение уровня ацетилхолина, широко применяются при расстройствах когнитивных функций, в частности, при болезни Альцгеймера (БА). Несмотря на широкий спектр современных антихолинэстеразных препаратов, многие из них обладают побочными эффектами и не всегда показаны пациентам пожилого возраста. Известно, что существуют две формы холинэстераз: ацетил- и бутирилхолинэстераза (АХЭ и БуХЭ), различающиеся по уровню экспрессии, локализации в ткани мозга и функциональным характеристикам. С возрастом в ткани мозга наблюдается снижение активности АХЭ и повышение активности БуХЭ, что делает необходимым создание ингибиторов, действующих избирательно на каждый из этих ферментов. В настоящем исследования было изучено влияние синтетических геропротекторных пептидов вилон (Lys-Glu) и эпиталон (Ala-Glu-Asp-Gly) на активность АХЭ и БуХЭ в клетках нейробластомы человека SH-SY5Y Также был проведен анализ влияния этих пептидов на активность фермента а-сек-ретазы предшественника амилоидного пептида (АРР), принимающего участие в неамилоидоген-ном пути расщепления АРР, и, возможно, в образовании растворимой формы АХЭ. Установлено, что инкубация клеток в течение 24 час в присутствии 50 нМ вилона или эпиталона приводила к снижению активности растворимой и мембраносвязанной форм АХЭ и БуХЭ в среднем на 30—60%. Оба препарата преимущественно ингибировали мембраносвязанную форму обоих ферментов и в большей мере активность БуХЭ. Эпиталон также повышал уровень активности а-секретазы в среднем на 20—25%. Полученные нами данные свидетельствуют, что вилон и эпиталон обладают селективными антихолинэстеразными свойствами, а эпиталон также способен активировать расщепление АРР и повышать продукцию его растворимой нейропротекторной формы.
Ключевые слова: ацетилхолинэстераза, бутирилхолинэстераза, белок предшественник амилоидного пептида (АРР), болезнь Альцгеймера, вилон, эпиталон, а-секретаза, нейробластома 8И-8У5У.
ВВЕДЕНИЕ
Болезнь Альцгеймера является одним из наиболее распространенных нейродегенеративных заболеваний нервной системы, сопровождающимся тяжелыми нарушениями деятельности мозга и встречающимся, в основном, у людей пожилого возраста. В связи с увеличением средней продолжительности жизни число людей, страдающих старческой формой данного заболевания, возрастает каждый год. По данным Международной организации здравоохранения сейчас в мире насчитывается около 30 миллионов людей, страдающих этим заболе-
*Адресат для корреспонденции: 194223 Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, д. 44; e-mail: n.n.nalivaeva@leeds.ac.uk.
ванием, а к 2020 г. их число составит 42 миллиона. Несмотря на многочисленные исследования морфологических, физиологических и биохимических основ болезни Альцгеймера, в настоящее время все еще нет ясной концепции патогенеза этого заболевания и адекватных подходов к его лечению. Одним из факторов, приводящим к гибели нервных клеток и когнитивным нарушениям, сопровождающим болезнь Альцгеймера, является патологическое накопление в ткани мозга агрегатов р-амилоидного пептида, являющегося основным компонентом так называемых сенильных бляшек. Последние являются одним из наиболее характерных морфологических признаков болезни Альцгеймера. Амилоидный пептид (Ар), образуется в результате протеоли-
за более крупных молекул белка предшественника амилоидного пептида или рАРР (р-amyloid precursor protein) под действием ряда протеиназ [1—3]. Амилоидный пептид обладает высоко выраженными фибрилогенными свойствами, и его олигомеры являются токсичными для нервных клеток, вызывая дегенерацию и гибель нейронов, и нарушение, в частности, холинергической синаптической передачи [4]. Применение ингибиторов холинэстераз является одним из основных симптоматических средств лечения и восстановления когнитивного дефицита при болезни Альцгеймера [5, 6]. Однако, несмотря на временное улучшение когнитивных функций, ингибиторы холинэстераз обладают разными побочными эффектами в зависимости от возраста пациентов [7, 8], а также не влияют на патогенез самого заболевания [9].
В организме человека и животных присутствует два типа холинэстераз, а именно ацетилхолинэсте-раза (АХЭ) и бутирилхолинэстераза (БуХЭ), являющиеся продуктами разных генов, локализованных на разных хромосомах. Так, в геноме человека ген АХЭ находится на хромосоме 7 (7q22), а ген БуХЭ локализован на 3-ей хромосоме (3q26) [10, 11]. Кроме того, существует несколько форм АХЭ, различающихся по характеру связи с плазматической мембраной клеток и имеющих различную тканевую и клеточную локализацию [12]. В ткани мозга помимо мембраносвязанной формы АХЭ также присутствует растворимая АХЭ, которая секретируется с поверхности нервных клеток при воздействии различных стимулов [13], возможно, в результате действия протеолитических ферментов, например, а-секретазы рАРР [14, 15]. Характер распределения АХЭ и БуХЭ в разных компартментах нервных клеток (БуХЭ, в основном в телах нервных клеток, а АХЭ в телах клеток и нервных окончаниях), а также преимущественная локализация БуХЭ в белом веществе мозга и глии свидетельствуют о различии их функций. В настоящее время все большее число авторов считает, что эти два фермента являются взаимозаменяемыми, а их функции перекрывают друг друга [16, 17]. В процессе старения и при БА в ткани мозга наблюдаются снижение уровня экспрессии и активности АХЭ, и повышение уровня БуХЭ, что, вероятно, носит компенсаторный характер, а также может быть фактором развития патологии [18, 19]. Существующие ингибиторы холинэстераз, применяющиеся при болезни Альцгеймера, имеют разную специфичность в отношении АХЭ и БуХЭ. Так, ривастигмин ингибирует оба фермента, а донепезил является специфическим ингибитором АХЭ. Как было показано, эффективность лечения этими препаратами зависит не только от возраста пациентов, но также от уровня экспрессии и полиморфизма гена БуХЭ [7].
В Институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН в течение ряда лет проводятся экспериментальные и клинические исследования геропротек-
торных свойств синтетических пептидов эпиталона (Ala-Glu-Asp-Gly) и вилона (Lys-Glu) [20], свидетельствующие об их высокой метаболической активности, в частности об их антиоксидантных свойствах [21]. В проведенном нами ранее исследовании было показано, что оба эти пептида способны восстанавливать уровень экспрессии амилоид-дегра-дирующих ферментов неприлизина и инсулин-деградирующего фермента в клетках нейробла-стомы человека NB7, после воздействия на них гипоксии [22].
Целью данного исследования было изучение влияния вилона и эпиталона на уровень активности растворимых и мембраносвязанных форм АХЭ и БуХЭ в клетках нейробластомы человека SH-SY5Y, а также на образование растворимых форм предшественника амилоидного пептида (АРР) и секрецию растворимых форм АХЭ и БуХЭ.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Культивирование клеток нейробластомы человека. Клетки нейробластомы SH-SY5Y культивировали в среде DMEM F-12 (Sigma, Англия), содержавшей 10% эмбриональной сыворотки телят, 5% пенициллина/стрептомицина, 5% L-глутамина и 1% незаменимых аминокислот. Клетки выращивали в 30 мл среды во флаконах площадью 175 см2 и разделяли через 4—7 дней. Температура в инкубаторе поддерживалась на уровне 37°C и концентрация СО2 составляла не более 5% (по объему). Содержание кислорода в инкубаторе было близким к содержанию кислорода в атмосферном воздухе. Перед разделением клетки промывали дважды 10 мл стандартного раствора 100 мМ фосфатного буфера (рН 7.2) и отделяли от поверхности флакона, инкубируя их в течение 2—3 минут в присутствии 2 мл 5% трипсина в фосфатном буфере (37°C). К полученной суспензии клеток добавляли 10 мл соответствующей стандартной среды, осторожно перемешивали при помощи пипетирования и пересевали в новые флаконы в разведении 1 : 10. При достижении клетками 70—80% конфлюэнтности культуральную среду заменяли на бессывороточную (как описано выше, но без эмбриональной сыворотки телят), добавляли водный стерильный раствор синтетических пептидов вилона и эпиталона до конечной концентрации 50 нМ и инкубировали в стандартных условиях. Через 24 часа среду отбирали для дальнейшего анализа, а клетки промывали дважды 10 мл стандартного раствора 100 мМ фосфатного буфера (рН 7.2) и снимали с поверхности флаконов с помощью пластикового шпателя. Суспензию клеток осаждали центрифугированием в течение 5 мин при 800 g.
Выделение фракций растворимых и мембраносвязанных белков. Фракции растворимых и мембрано-связанных белков из клеток нейробластомы получали по методу [15], в модификации подробно опи-
санной нами ранее в [23]. Для этого осадок клеток гомогенизировали в 1 мл 0.02 M Tris-HCl (pH 7.5), 0.01 M MgCl2, 0.05 M NaCl и центрифугировали в течение 10 минут при 500000 g на ультрацентрифуге Beckman TL100 (Beckman, США). Полученный су-пернатант использовали для анализа растворимых белков, а осадок ресуспензировали в 1 мл 0.01 M фосфатного буфера (pH 7.4), содержащего 1% Triton X-100. Суспензию инкубировали на льду в течение 1 часа для экстракции мембраносвязанных белков и центрифугировали в течение 10 минут при условиях, описанных выше, для удаления нерастворимых белков, прочно связанных с цитоскелетом клеток.
Определения содержа
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.